游離脂肪酸對糖尿病大鼠心腎病理改變的影響

王震靜等

【摘要】 目的 對雄性Wistar糖尿病大鼠外源性輸注脂肪乳，提高大鼠血液中游離脂肪酸（FFA）的濃度，觀察大鼠在不同濃度游離脂肪酸作用下，心肌細胞直徑的改變、腎小球體積的改變以及心肌和腎小球上白介素-6（IL-6）的不同表達。方法 制作糖尿病大鼠模型，按照隨機數字表編號將DM大鼠分入對照組和實驗組，頸靜脈穿刺插管，在輸液前后，分別經頸靜脈內采血，分離血清，待檢測，實驗結束，分離心臟及兩側腎臟，測量左側腎臟質量，將心腎組織用4%中性甲醛固定，制作切片，進行HE染色和免疫組化組織染色。EllisAE法檢測血清FFA，光學顯微鏡下測量各組大鼠心肌細胞直徑和腎小球面積，計算腎小球平均體積（VG）并計算腎重體重比值，測量各組的心肌和腎小球的IL-6光密度值，統計各組數據之間的差異是否有統計學意義及其相關系數。結果 ①實驗組大鼠的血清FFA水平明顯升高，比對照組升高2-4倍。實驗組大鼠隨著脂肪乳輸注時間的增加，腎重體重比值漸變大，4天組、6天組有統計學意義，與游離脂肪酸相關系數為0.782，P<0.01。實驗組大鼠的腎小球體積隨著脂肪乳輸注時間的增加而增加，自2天組開始腎小球體積增大有統計學意義，與血清中游離脂肪酸相關系數為0.837，P<0.01，與腎小球IL-6的表達相關系數為0.843，P<0.01。②對照組大鼠腎小球中IL-6基本不表達或弱表達，測量其平均光密度分別為0.1612、0.1583、0.1579；實驗組大鼠IL-6水平較對照組明顯增高，2天組、4天組、6天組光密度分別為0.2173、0.4409、0.5294，2天組開始就有統計學意義。③心肌細胞HE染色顯示：實驗組大鼠較對照組大鼠心肌細胞肥大，隨著脂肪乳輸注時間的延長，心肌細胞直徑漸增大，4天組、6天組有統計學意義。隨著脂肪乳輸注時間延長，心肌細胞局部IL-6表達增多，自2天組就有統計學意義，與FFA濃度相關系數為0.753，P<0.01，與心肌細胞局部IL-6光密度水平相關系數為0.808，P<0.01。結論 游離脂肪酸引起糖尿病大鼠腎重體重比值增加、腎小球體積增大、腎小球局部IL-6表達增加，并且隨著脂肪乳注射時間延長，上述改變明顯。腎重體重比值和腎小球的改變可能與局部IL-6高表達相關。游離脂肪酸引起糖尿病大鼠心肌細胞肥大，隨著FFA濃度的增加，肥大明顯，肥大改變可能與局部IL-6表達相關。

【關鍵詞】 Wistar大鼠；糖尿病；游離脂肪酸

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.004 文章編號：1004-7484（2013）-06-2863-02

1 材料和方法

1.1 實驗動物及糖尿病動物模型的建立 健康雄性Wistar大鼠30只，6-8周齡，體重180-200g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。（SPF級），普通飼料適應性喂養l周，后給予高脂飲食4周。

使用前臨時配制STZ溶液。高脂飼料喂養4周后的大鼠，禁食12h過夜后，稱重，按照40mg/Kg，腹腔注射1%STZ一次。繼續高脂喂養72小時，血糖檢測，空腹血糖（FBG）≥1l.lmmol/L者為DM大鼠，有28只經檢驗成模，進入實驗。

1.2 研究對象和分組 按照隨機數字表將大鼠分入輸入生理鹽水的對照組和輸入脂肪乳的實驗組。實驗組繼續給予高脂飲食一周，對照組普通飼料飼養。

1.3 方法操作

1.3.1 大鼠頸靜脈穿刺插管手術 稱重，用3%戊巴比妥鈉（4mg/Kg）腹腔注射麻醉，暴露并分離右側頸靜脈，以PE50軟質塑料管行頸靜脈插管，插管深度約1-2cm。遠端穿過皮下固定于頸背部皮膚處。

1.3.2 靜脈輸注 經大鼠頸背部導管采血后，靜脈導管與微量輸液裝置連接，以微量輸液泵24小時連續輸注。FFA組（n=15）：輸注20%英脫匹利特+肝素鈉（英脫匹利特：肝素鈉=lml：40UI），輸注速率0.6-1ml/h，以維持循環中FFA水平高于基礎值2-4倍，輸液持續2-6天（FFA-2d：n=5，FFA-4d：n=5，FFA-6d：n=5）；NS組（n=13，NS-2d，n=5，NS-4d，n=4，NS-6d，n=4）以相同速率（0.6-1.0ml/h）連續靜脈輸注生理鹽水。實驗結束，經頸靜脈內采血，分離血清，于-80℃冰箱保存，測定血FFA水平。

1.4 主要試劑與儀器

1.4.1 主要儀器 ①顯微照相系統，日本奧林巴斯（Olympus，TurboScan）

②生物顯微照相分析系統，（日本Olympus，BX51）。

1.4.2 試劑 ①血清游離脂肪酸試劑盒，上海研吉生物科技有限公司；②免疫組化試劑盒一抗、二抗、DAB顯色劑均購于北京中杉生物技術有限公司。

1.5 切片制作 分離心臟、腎臟，左側腎臟除去包膜稱重，取心臟組織，腎臟組織固定于4%的中性甲醛中，制切片，并進行HE常規組織染色和IL-6免疫組化染色。

1.6 IL-6組織局部沉積 IL-6染色陽性物質為棕黃色，利用顯微圖像分析系統進行圖像采集，分析腎小球內IL-6在組織局部表達的情況，可見對照組大鼠腎小球中IL-6基本不表達或弱表達，平均光密度分別為0.1612、0.1583、0.1579；實驗組大鼠，腎小球中IL-6水平較對照組增高，2天組﹑4天組﹑6天組的光密度分別為0.2173、0.4409、0.5294，2天組開始就有統計學意義。

1.7 腎重體重比值和平均腎小球體積的計算 計算各對照組和實驗各組中大鼠的腎重體重比值，得出，實驗4天組腎臟體重比值開始有統計學意義，應用OlympusBX51分析系統測定各組大鼠HE染色腎小球等效直徑和平均截面積（AG），據公式VG=l.38/1.1×AG3/2算出腎小球平均體積（VG），并計算其與游離脂肪酸的相關性，經PEARSON分析其相關系數為0.837。

1.8 心肌細胞直徑（MCD）測定 將心肌切片在400倍光學顯微鏡下測定MCD，每張HE染色切片選取6-8個不重復的視野，每個視野測量5-10個心肌細胞，每一標本測量50個心肌細胞，以平均值作為該樣本MCD進行分析。在被測定的心肌細胞，在橫向上，細胞核位于細胞的中央，其最短徑線為MCD[1]。2天組開始大鼠心肌細胞較對照組大鼠相比直增徑大。心肌細胞直徑與游離脂肪酸濃度的相關系數經PEARSON分析為0.789，與心肌局部IL-6水平的相關系數r為0.808。

1.9 統計學處理 定量結果用（χ±s）表示。采用SPSS13.0軟件進行系統分析，組間比較采用t檢驗。相關性用PEARSON相關分析，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 論

2.1 隨著脂肪乳輸注時間的延長，糖尿病大鼠體內FFA濃度增高，腎重體重比值增加、腎小球體積增大，腎小球局部IL-6的表達指標—光密度也有增高趨勢，腎臟的體積增大可能與局部IL-6高表達相關。

2.2 隨著脂肪乳輸注時間的延長，糖尿病大鼠體內FFA濃度增高，糖尿病大鼠心肌細胞直徑變大，隨著FFA作用時間的延長，肥大病變趨于明顯，且局部IL-6表達增加，說明FFA可能引起心肌細胞肥大，并且程度與FFA濃度和持續時間呈正相關，機制可能與局部IL-6表達水平相關，見表1、表2。

3 討 論

動脈粥樣硬化是糖尿病患者常見的并發癥，從病理生理學和流行病學的角度都能說明糖尿病與大血管疾病的密切關系。糖尿病大血管病變在組織病理學上與動脈粥樣硬化并無差異，但其發生早、進展快、預后差，糖尿病大血管疾病的發生率和病死率更高。

FFA導致大血管病變的機制可能為：①FFA通過對NO生成的抑制，對血管內皮細胞的損傷，血管內皮功能失調是動脈硬化的始動因素。NO生成的減少，內皮細胞依賴性血管舒張功能受損，將啟動和加速動脈粥樣硬化病理過程發生。②FFA通過增加氧化應激產物損傷血管內皮。③FFA增加導致脂蛋白成分異常：在膽固醇酯轉移蛋白存作用下，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的膽固醇和VLDL的TG交換增加，形成富含膽固醇的致動脈粥樣硬化的VLDL和富含TG而膽固醇少的HDL、LDL。肝脂肪酶或脂蛋白酶水解富含TG的LDL，形成有著更強致AS作用的小而密VLDL。富含TG的HDL更易被肝脂肪酶水解而失去心血管保護作用[2]。

文中通過研究論述糖尿病大鼠腎重體重比值與腎小球體積的增大可能機制，以期待對于糖尿病腎病的發病原因做一探究，對糖尿病腎病的早期預防和治療提供依據。

參考文獻

[1] ItoH，et a1.ENC othelin ETA receptor antagonist blocks cardiac hypertrophy provoked by hemodynamic overload[J].Circulation，l994，89（5）：2198-2203.

[2] 楊文英.從脂毒性到糖尿病再到血脂異常[J].國外醫學內分泌學分冊，2004，24：287-288.

[3] 季宏，卞茸文，婁青林，等.頸動脈粥樣硬化危險因素分析[J].南京醫科大學學報，2006，26（9）.