谷氨酸轉運體在高熱驚厥大鼠腦內的表達及意義

周蕊　孫妍　李俊利

【摘要】 目的 探討大鼠反復高熱驚厥后腦內谷氨酸及谷氨酸轉運體的表達情況，進行定性及定量分析。方法 熱水浴法建立FS模型。15日齡雄性Wistar大鼠60只，隨機分為正常對照組（n=10）和高熱處理組（n=50），其中高熱處理組按大鼠是否有驚厥又分為高熱未驚厥組和高熱驚厥組。免疫組織化學法檢測谷氨酸及谷氨酸轉運體在大鼠腦組織各區的表達。結果 ①驚厥對照組大鼠皮層及海馬CA3區Glu的表達較正常對照組明顯增加。②驚厥對照組大鼠皮層及海馬CA3區GLT-1的表達均低于正常對照組。討論 高熱驚厥時腦細胞谷氨酸表達上升，而腦細胞膜和細胞間質中的谷氨酸轉運體GLT-1表達下降。

【關鍵詞】 高熱驚厥；谷氨酸；谷氨酸轉運體

高熱驚厥（febrile convulsion，FC）是一種特殊類型的癲癇綜合征，是小兒時期最常見的驚厥性疾病，但反復發作或長時間發作的FC可造成腦損傷，目前對本病的研究仍集中于對其行為及腦電圖變化的觀察，而對其神經病理改變的研究較少。本研究用熱水浴驚厥模型誘導生后15dWester大鼠發生熱性驚厥，利用免疫組織化學方法對正常對照組、高熱及高熱驚厥組大鼠腦內谷氨酸及谷氨酸轉運體的表達情況進行定性及定量分析，為熱性驚厥時的神經病理學研究提供新思路

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 15日齡雄性Wistar大鼠60只，體重30-45g，（購自內蒙古大學實驗動物中心）。自由喂養1d后進行實驗。將大鼠稱重后編號，隨機分為正常對照組（37.0℃水浴，n=10）和高熱處理組（45.2℃水浴，n=50），其中高熱處理組按大鼠是否有驚厥又分為高熱未驚厥組和高熱驚厥組。從正常對照、高熱未驚厥和高熱驚厥組中，分別隨機取10只用于進行腦組織免疫組織化學染色觀察。

1.2 化學試劑 本實驗中所采用的化學試劑及免疫組化試劑盒分別購自北京化學試劑公司及福州邁新生物科技公司。

1.3 熱性驚厥動物模型的建立 參照文獻報道[1]建立熱性驚厥動物模型，高熱驚厥組熱水浴：水浴箱溫度設定為45.2℃。從大鼠生后15d開始，隔日誘導驚厥1次，共10次。正常對照組水浴溫度為37℃，處置方法同高熱驚厥組。記錄大鼠的驚厥潛伏期、驚厥時體溫、驚厥持續時間及驚厥級別評[2]（驚厥分級：0級0分：無驚厥；1級1分：面部抽動；2級2分：點頭；3級3分：前肢陣攣抽搐；4級4分：全身強直；5級5分：全身強直陣攣）。

1.4 腦組織谷氨酸和谷氨酸轉運體表達檢測

1.4.1 腦標本取材和切片制備并進行免疫組化染色 各組在FC組末次驚厥24h予100g/L水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛PB左心室灌注固定，取腦，后固定6-8h。腦標本入30%蔗糖磷酸緩沖液（PH=7.4）過夜自頭端向尾端連續凍切腦片，厚30μm切片，連續取片，三張為一套，分別進行尼氏染色組織定位和Glu及GLT-1免疫組化染色。

1.4.2 圖像結果處理 每張切片分別在海馬CA3區、顳葉皮層（CTL）隨機觀察5個不連續視野（×400），使用Olympus自動圖像采集系統進行圖像采集，腦片呈現棕黃色區域為陽性反應，用IPP軟件分析系統進行計數和平均光密度分析，取其OD值。

1.5 統計學分析 應用SPSS12.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（χ±s）表示，獨立樣本t檢驗和單因素方差分析進行組間比較，以P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 熱水浴誘導大鼠驚厥結果 正常對照組大鼠在37.0℃水浴中，游動自如，出水前后無異常變化。高熱驚厥組大鼠在45.2℃熱水中，每次誘導均發展為驚厥，驚厥時的時體溫在42℃-44℃之間，平均體溫為（42、8±0、4℃），第1次驚厥發作最長潛伏期為5min57s，以后隨誘發次數的增加，驚厥閾值逐漸降低，驚厥潛伏期呈縮短趨勢（第2-10次，最長驚厥潛伏期分別為5min30s、5min19s、4min51s、4min35s、4min2s、3min45s、3min25s、3min4s、2min47s、）。但驚厥發作程度及發作時間無顯著趨勢性變化。總的驚厥級別多為4-5級。驚厥發作3次后，部分大鼠出現行為改變，表現為易激惹，攻擊性強或反應遲鈍、活動減少。

2.2 谷氨酸（Glu）、谷氨酸轉運體（GLT-1）在大腦皮層及海馬的表達 驚厥對照組大鼠皮層及海馬CA3區Glu的表達較正常對照組明顯增加，表現為計數、平均光密度與正常對照組相比增加有統計學意義（P<0.01），見表1。驚厥對照組大鼠皮層及海馬CA3區GLT-1的表達均低于正常對照組，表現為計數、平均光密度值較正常對照組明顯減少（P<0.01），見表2。

3 討 論

人類熱性驚厥多發于6個月-3歲，研究表明，生后5-7d大鼠的腦發育程度與足月新生兒的腦發育程度相當，15d大鼠的腦發育程度與1歲兒童相當，28-30d大鼠的腦發育程度與2歲兒童相當[3]。大鼠55d左右進入青春期，60d性成熟。本研究中的大鼠從15日齡開始，反復誘發熱性驚厥，其年齡段與人類熱性驚厥的好發年齡相當，模擬人類有熱驚厥史的癲癇發作。

本研究利用熱水浴誘導大鼠FC模型，每2d誘導大鼠FC發作1次，觀察到大鼠驚厥行為、驚厥時的體溫、潛伏期及驚厥持續時間均與Jiang等[2]的報道相符，此外，熱水浴誘導模型所需器材簡單，水溫等因素較易控制，本研究觀察大鼠FC3周，Jiang等觀察大鼠FC時間長達半年，所以該模型是一簡便易行的FC模型，并適合于長期觀察與研究。

谷氨酸轉運體（GluTs）是位于神經元和膠質細胞膜上的一種糖蛋白，在谷氨酸的再循環，維持突觸的正常傳遞及保護神經元免受神經興奮毒性損害等方面有重要作用。到目前為止，已分離和克隆出五種亞型，即EAAT（EAAT1-EAAT5），EAAT2也稱為GLT-1，在中樞神經分布廣泛，也表達在發育階段的神經元上。其轉運的谷氨酸占全部谷氨酸攝取的90%在生理條件下，EAAT迅速攝取谷氨酸，有效地抑制了細胞外谷氨酸的堆積。病理情況下，EAAT對谷氨酸的攝取能力下降或者中斷，甚至出現向細胞外的逆轉運，導致細胞外谷氨酸濃度上升，興奮谷氨酸受體，引發一系列興奮性毒性。熱性驚厥時腦缺氧、缺血，谷氨酸由于過度釋放或攝取障礙而大量積聚，使其腦內濃度急劇升高，引起突觸間隙或胞外Glu大量蓄積，通過作用于相應的谷氨酸受體（GluRs）導致Na+、Ca2+內流增加，使細胞急性滲透性腫脹以及細胞內Ca2+超載，能量消耗、自由基大量形成，嚴重或反復發作將造成腦損傷。本實驗中，熱水浴大鼠產生了與文獻報道相一致的發熱乃至驚厥，在此基礎上，觀察了皮層及海馬CA3區Glu的表達變化，發現其有顯著升高，而GLT-1的表達明顯降低。因此上調GLT-1，增強其對于谷氨酸的攝取可能在熱性驚厥的發生機制和防治中具有重要作用。

參考文獻

[1] 周國平，秦炯，湯秀英，等.高熱驚厥大鼠海馬神經元數量和超微結構改變的實驗研究[J].中華兒科學雜志，2001，39：105-108.

[2] Jiang W，Duong TM，DeLanerolle NC.Neuropathology of Hyperthermic seizures in the rat[J].Epilepsia，1999，（40）：5-19.

[3] 左啟華，主編.小兒神經系統疾病[M].第2版.北京：人民衛生出版社，2002，231-232，425-426.