非小細胞肺癌患者外周血Survivin mRNA的表達及臨床意義

張倩馨　蔡永清

【摘要】 目的 通過對非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）患者外周血生存素（Survivin）mRNA的檢測；探討其對NSCLC診斷的臨床價值和意義。方法 采用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測55例非小細胞肺癌患者、60例對照組的外周血Survivin mRNA的表達情況。結果 Survivin mRNA在NSCLC組的陽性率顯著高于對照組（P<0.01）。陽性表達率與臨床TNM分期有統計學意義（P<0.01），與性別、年齡、病理組織類型無統計學意義（P>0.05）。結論 外周血Survivin可作為早期輔助診斷NSCLC及微轉移的一個有價值的腫瘤標志物。

【關鍵詞】 Survivin mRNA；外周血；RT-PCR；非小細胞肺癌

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.053 文章編號：1004-7484（2013）-06-2913-01

肺癌目前是全世界發病率、死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占80-85%[1]，但目前缺乏特異且敏感的早期病變的診斷指標。外周血中腫瘤標志物的檢測有助于發現常規方法不能發現的存活于血循環中的微小腫瘤細胞灶。本研究旨在通過RT-PCR方法檢測NSCLC患者外周血中survivin mRNA的表達情況，探求NSCLC早期診斷、早期血道微轉移檢測的特異、敏感指標，為臨床應用提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗對象 選擇2010年4月至2011年2月大連醫科大學附屬第一醫院收治的相關患者。惡性腫瘤組55例：男性31例，女性24例，年齡30-77歲；其中腺癌40例，鱗癌14例，大細胞癌1例。所有病例均經病理檢查證實。患者采血前均未行化療或放療。對照組包括肺部良性病變組30例：男性18例，女性12例，年齡23-74歲；其中肺炎19例，肺結核球4例，炎性假瘤7例。正常健康對照組30例：男性15例，女性15例，年齡21-69歲，均無心、肝、肺等器質性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在Gene Bank查找Survivin mRNA、β-actin mRN（內參）基因序列，引物由大連寶生物公司合成。

1.2.2 標本采集及Total RNA的提取 用枸櫞酸鈉抗凝經去酶處理的采血管，取患者晨空腹肘靜脈血2.0ml。

淋巴細胞分層液分離核細胞，RNAiso Plus細胞裂解液裂解，氯仿，異丙醇進一步抽提總RNA。總RNA用紫外分光光度計定量，并行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，加入適量RNase-free滅菌水分裝-80℃保存備用。

1.2.3 RT-PCR 逆轉錄反應條件42℃30min、95℃5min、5℃5min。在PCR反應儀中進行。反應產物-20℃保存備用。PCR擴增反應條件94℃5min，變性94℃30s，72℃延伸1min，共進行30個循環，最后72℃延伸5min.，Survivin mRNA復性62℃30s，β-actin mRNA56℃30s

1.3 統計學處理 應用SPSSV17.0統計軟件包處理，用X2檢驗分析計數資料之間的比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 總RNA鑒定 實驗中所抽提取的總RNA，其檢測的OD260/OD280值為1.8-2.2之間。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳及EB染色分析可見28s、18s、5s三條帶，表明完整性良好。

2.2 RT-PCR擴增圖 用大連寶生物公司的DNA MarkerD（100bp-2000bp）作為相對分子量的質量標準，電泳結果可顯示5條帶（100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp）。指標Survivin mRNA的擴增產物為439bp；以β-actin mRNA268bp作為內參照，其在本實驗所有標本中均穩定表達。陽性表達電泳圖表現為439bp出現亮帶。1%瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。

2.3 3組外周血Survivin mRNA 的表達情況比較 在55例非小細胞肺癌組中Survivin mRNA表達率為61.82%；肺良性病變組表達率6.7%；健康對照組無陽性表達。非小細胞肺癌組較肺良性病變組及健康對照組差異有統計學意義（P=0.00）。Survivin mRNA在不同TNM分期、不同差異具有統計學意義（P=0.004）。不同病理類型組、不同年齡組、不同性別組的非小細胞肺癌患者，Survivin mRNA差異無統計學意義（P=0.446 、P=0.701和P=0.446），見表1。

3 討 論

多數非小細胞肺癌患者在確診時已有遠處轉移。早發現、早診斷、早治療是提高非小細胞肺癌患者生存率和治愈率的關鍵。相對于傳統方法，外周血腫瘤標志物檢測是一個合理、安全、花費較小的選擇。非小細胞肺癌患者血循環中微轉移陽性的，生存期明顯縮短，預后差[2]。因此選擇適宜的方法，并在外周血中找到有助于非小細胞肺癌早發現、早診斷的腫瘤標志物具有重要的臨床意義。RT-PCR是具有高度敏感性及異性的檢測外周血腫瘤細胞的方法，目前得到了廣泛應用，其檢測的是基因在mRNA水平表達的情況，能在106-107個正常的細胞中檢出1個腫瘤細胞，優于傳統檢測技術，適于用來檢測外周血循環中存在的微量腫瘤細胞。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，是目前發現的最具特異性的凋亡抑制因子之一。其特異性高表達于腫瘤組織，正常分化的組織則不表達。該特性決定了其可能為理想的腫瘤標記物，并成為腫瘤鑒別診斷以及判斷預后等研究的新熱點。Yie等研究發現，Survivin表達陽性者具有較高的復發率，生存期較短；通過多因素分析，Survivin是癌癥復發的獨立預測因子。Chen P的研究發現Survivin和臨床分期是對無進展生存期和總生存期的獨立預測因子。本實驗發現外周血survivin mRNA的檢測有助于早期血道微轉移的發現，且隨著TNM分期的增高，Survivin mRNA陽性表達率也顯著增加，其在外周血中的表達可能是肺癌惡化發生復發轉移所伴隨的分子生物學變化，進一步提示其與患者預后息息相關。本研究認為采集外周血的方法，簡便、安全易于臨床應用。

參考文獻

[1] Manegold C.Thatcher N.Survival improvement in thoracic cancerl progress from the last decade and beyond[J].Lung Cancer，2007，57 SuppI 2：S3-S5.

[2] Yamashita JI，Kurusu Y，Fujino N，et al.Detection of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer undergoing lobectomy by video-assisted thoracic surgery：a potential hazard for intraoperative hematogenous tumor cell dissemination[J].Thorac Cardiovasc Surg，2000，119（5）：899-905.