牛奶中黃曲霉毒素M1常見檢測方法比較

萬珊 朱曦 梁利妹 董文婷

摘要：黃曲霉毒素M1（ AFM1）是動物攝入黃曲霉毒素B1（AFB1）后在體內經羥基化形成的代謝產物，具有極強的毒性，存在于乳中。介紹了黃曲霉毒素M1（ AFM1） 的危害以及牛奶中黃曲霉毒素M1的薄層色譜（TLC）檢測法、高效液相色譜（HPLC）檢測法和快速檢測法，并比較了各種方法的優缺點和適用范圍。

關鍵詞：黃曲霉毒素 M1；危害；檢測方法；比較

中圖分類號：TS252.7 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）06-0078-03

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產物，之所以廣受重視是因為它是人類癌癥的一個重要的致癌源。至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，在天然食物中以黃曲霉毒素B1最為多見。在AF中，已知毒性大小順序為AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG。

黃曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1，AFM1）是動物攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在體內經羥基化形成的代謝產物，毒性僅次于AFB1，WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中，其中以乳中最為常見。

把發霉的谷物作為飼料，其中的黃曲霉毒素在24 h之后就能進入奶中。王蕾指出黃曲霉毒素被動物食用后，一部分會蓄積在動物的體內，另外一部分則會轉化到乳汁和尿液中，轉化率一般為3.45%～11.39%[1]，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%[2]。

1 黃曲霉毒素M1的基本性質及危害

黃曲霉毒素基本結構由一個二呋喃環和一個氧雜萘鄰酮組成，前者為其毒性結構，后者可能與其致癌作用有關。黃曲霉毒素M1一旦產生便很難消除，因為它對光、熱和酸都比較穩定，熔點（裂解溫度）在299 ℃。牛奶常見的3種消毒方法都對它無可奈何。

黃曲霉毒素M1進入人或動物體內后，除抑制DNA、RNA合成外， 也抑制肝臟蛋白質合成，導致人體中毒。其危害主要表現在3個方面：損害組織器官；致癌、致畸、致突變，引發動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等[3-5]；抑制免疫機能。其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝臟。

2 牛奶中AFM1的限量

牛奶中AFM1限量取決于科學、社會和經濟方面的諸多因素，這些因素相互影響、制約，綜合地決定牛奶中AFM1限量值。目前，世界各國對食品中AFM1的含量都制定出了嚴格的限量標準。牛奶中AFM1限量值采用0.05 μg/kg的國家最多，為34個，其中絕大部分國家是歐盟成員國以及與歐盟有貿易的非洲、亞洲、拉丁美洲部分國家，歐盟對嬰幼兒配方食品，包括嬰幼兒配方牛奶限量0.025 μg/kg。另一個限量值為0.5 μg/kg，有22個國家，包括美國、中國以及若干亞洲和歐洲國家。還有4個國家分別采用15、5、0.2 μg/kg以及不得檢出[6]。一些主要國家牛奶中AFM1的限量標準見表1。

3 牛奶中AFM1的檢測方法

3.1 薄層層析法（TLC法）

TLC法是測定牛奶中黃曲霉毒素的經典方法，是通過肉眼比較定性或者半定量的檢測方法。其原理是將樣品經提取、濃縮、薄層分離后，AFM1在紫外光（波長365 nm）下產生藍紫色熒光，根據其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量與標準溶液的熒光強度相比較來測定含量。GB 5009.24～2010食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定、ISO 14674：2005（IDF 190：2005）牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1的測定、AOAC 974.17乳制品中黃曲霉毒素M1的測定和AOAC 980.21牛奶和奶酪黃曲霉毒素M1的測定就是采用的TLC法[7-10]。

TLC法的優點在于不依賴特殊儀器，成本低，易于普及，雙向展開避免了雜質干擾，被用于大規模的篩查研究中。雖然TLC法是牛奶中黃曲霉毒素M1 測定的官方規定方法之一，但是隨著高效液相色譜和液相色譜-質譜連用技術的發展，TLC的缺點也逐漸顯現：對樣品處理繁瑣，過程復雜，且提取和凈化效果不夠理想，雙向展開增加了操作步驟和時間，對人和環境污染系數較大。

3.2 高效液相色譜法（HPLC法）

HPLC法是利用免疫親和柱或C18柱將樣品中的AFM1萃取、凈化、濃縮、分離，再通過HPLC串聯不同檢測器進行檢測。免疫親和柱是利用抗原抗體的特異性吸附特性， 親和柱只能特異性、選擇性地吸附AF，而其他雜質則順利通過柱子， 然后再利用洗脫液將AF洗脫下來。該方法大大簡化了樣品的前處理過程， 同時利用高效液相色譜進行定量和定性， 可以同時測出AF的總量和AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2各自含量。我國GB/T 23212～2008牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的測定和GB 5413.37～2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第一法免疫親和層析凈化液相色譜-串聯質譜法、第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法）均是采用免疫親和柱萃取分離AFM1[11，12]。熒光（Fluorescence detection， FLD）、質 譜（Mass spectrometry， MS）等的定量測定被廣泛用于牛奶中AFM1的檢測。

3.2.1 HPLC-FLD 配以熒光檢測器的反相HPLC法已經成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法，這是因為反相HPLC方法具有同時分離多種黃曲霉毒素的功能和快速、高效、靈敏、定量準確的優點，而且不受樣品的沸點、熱穩定性和分子量等的限制；熒光檢測器具有靈敏度高、選擇性強、分離能力強、干擾峰少的優點，而牛奶中AFM1具有較強的發射熒光特性。

3.2.2 HPLC-MS 質譜法是通過將試樣分子裂解為分子離子和各種離子碎片的集合，按質荷比（m/z）大小進行分離、記錄的分析方法。MS檢測器具有更高的選擇性、對分析物分子標識的確證、可用同位素標記作為內標等優勢，HPLC-MS比傳統液相檢測器靈敏度更高，選擇性更強，提供了可靠、精確的相對分子質量及結構信息，簡化了試驗步驟，節省了樣品準備時間和分析時間，廣泛應用于AFM1的檢測中。ISO 14501：2007（IDF 171：2007）牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1含量的測定和我國GB 5413.37-2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第一法免疫親和層析凈化 液相色譜-串聯質譜法）采用的就是LC-MS法檢測奶中的黃曲霉毒素M1[12]。

3.3 免疫層析凈化熒光分光度法

免疫層析凈化熒光分光度法的原理是將試樣經過離心、脫脂、過濾后，濾液經過含有黃曲霉毒素M1特異性單克隆抗體的免疫親和柱層析凈化，除去其他雜質， 再洗脫下黃曲霉毒素M1，用熒光光度計測定黃曲霉毒素M1的含量。其中測定時是先用熒光光度計標定溶液進行熒光光度計校準，再進行AFM1的含量的測定。優點在于分析過程中不使用AFM1的標準物質，避免了操作人員造成的污染危險，不用擔心AFM1標準品的購買困難，具有準確、快速、安全、簡單等特點，可以滿足少量和批量樣品的檢測需要[13]。我國GB 5413.37-2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第三法免疫層析凈化熒光分光度法）采用的就是此種方法檢測奶中的黃曲霉毒素M1[12]。

3.4 快速檢測法

3.4.1酶聯免疫吸附法（ELISA） 酶聯免疫分析技術在黃曲霉毒素分析過程中是最為引人注目的，因為它們具有高度的靈敏度和選擇性，而且具有快速和大批量檢測的能力。ELISA的原理是樣品中的黃曲霉毒素與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，在固相載體表面形成抗原抗體復合物。洗除多余抗體成分，加入酶標Ⅱ抗，與抗體反應通過酶催化顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中黃曲霉毒素的含量。

ELISA具有快速、靈敏、特異性強、成本低等特點，大大減輕了工作人員的勞動量，樣品不需特殊處理，直接測定，儀器操作簡單，適合于AFM1大批樣品的檢測篩選，可用于現場檢測。我國DB33/T 556-2005乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定使用酶聯免疫吸附法，ISO 14675：2003（IDF186：2003）牛奶和牛奶制品，競爭酶聯免疫分析的標準化描述指南.黃曲霉毒素M1含量的測定即為ELISA法[14，15]。競爭性酶聯免疫吸附試驗從1995年起已成為AOAC檢測黃曲霉毒素的官方方法。

3.4.2 膠體金法 膠體金法基于競爭法膠體金免疫層析技術，用于快速篩查含有AFM1 的液態奶、奶粉（含嬰兒奶粉）和飼料等樣品。此法將檢測樣品液加入速測卡上的樣品孔，檢測液中的AFM1與金標卡上的金標抗體結合形成復合物，若AFM1在檢測液中濃度低于設定檢測靈敏度值（陰性樣本），未結合的金標抗體流到T區時，被固定在膜上的抗原捕獲，形成一條可見的T線；若AFM1 濃度高于設定檢測靈敏度值，金標抗體即與AFM1全部形成復合物，不再與T線處抗原結合，T線不可見。C線為質控線，出現則說明該速測卡有效。鄧省亮等[16]、孫秀蘭等[17]等分別制備和研究了膠體金檢測卡以及樣品基質對試紙條信號靈敏度的影響，并為消除這些影響提供了經驗。市面上的速測卡盒在2～8 ℃可穩定保存4個月，檢測一個樣品費用僅需幾十元。此方法快速便捷，操作簡單，成本低，適用于大量篩查牛奶中AFM1，節省了人力、物力、財力。

3.4.3 SNAP法 利用酶聯免疫競爭原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M1與定量特異性酶標抗體反應，多余的游離酶標抗體則與酶標板內的包被抗原結合，通過流動洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標準點比較定性。GB 5413.37～2010 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第四法）和NY 1664～2008 牛乳中黃曲霉毒素M1的測定均采用此法[12，18]。

4 小結

目前， 人們逐漸認識到牛乳具有提高機體免疫力、增強體質等優點， 已成為不可缺少的常用食品，牛奶的安全性也日益受到重視，所以對于牛奶中AFM1的污染控制是牛奶生產中的重中之重。

薄層層析法是經典方法，一般實驗室均能完成，雖不斷改進，但在抗干擾、精密度方面仍有缺陷，且步驟繁瑣，對人員危害大。親和柱HPLC-FLD靈敏度、精密度等均可滿足AF檢測要求。HPLC-MS具有預處理簡單、檢測速度快、靈敏度高的優點，可以滿足少量和批量樣品的檢測需要，但對于儀器要求較高，成本也較高。免疫層析凈化熒光分光度法測定過程中不使用AFM1的標準物質，避免污染危險，具有準確、快速、安全、簡單等特點。根據其特點這幾種方法適合實驗室檢測。ELISA、膠體金法和SNAP法適合于現場篩查。ELISA使用安全，操作簡便、快捷，適合大批量樣品篩查，但適用酶、抗體對保存條件、時間又有一定要求。膠體金法和SNAP法更加方便快捷，但主要用于定性。此外，乳及乳制品特別是生乳的貯存條件特殊，不宜長時間運輸貯存，快速檢測對大規模監測具有重要意義。同時，快速的現場檢測可以提高檢測效率，加大監測范圍和力度，保證牛奶質量安全。采用快速檢測技術（最好是膠體金速測卡）初步篩查后，再用HPLC-FLD法、HPLC-MS法等定量法對快速法篩選出的陽性或超標樣品進一步確證，這可能是解決大批量牛奶檢測的最好方法。

參考文獻：

[1] 王 蕾.牛奶中黃曲霉毒素M1檢測方法的建立及飼料中黃曲霉毒素對牛奶品質的影響[D].河南農業大學，2008.

[2] VELASCO R M L， DELSO M M C， ESCUDERO D O. ELISA and HPLC determination of the occurrence of alfatoxin M1 in raw cow's milk[J].Food Addit Contam，2003（20）：276-280.

[3] 陳愛民，徐耀初.AFT致肝癌的分子機制及其化學預防[M] .國外醫學：衛生學分冊，1998，25（5）：285-288.

[4] 卿中全，于炎湖.AFT對家禽生產性能和健康的影響[J] .中國飼料，2000（3）：35-37.

[5] MISHRA H N， CHITRANGADA D. A review on biological control and metabolism of aflatoxin[J]. Critical Reviews in Food Science and Nuteition，2003，43（3）：245-264.

[6] 黃良策，程建波，鄭 楠，等.牛奶中黃曲霉毒素M1檢測方法研究進展[J]. 食品安全導刊，2012（3）：39-41

[7] GB 5009.24-2010，食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定[S].

[8] ISO 14674：2005（IDF 190：2005），牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1的測定[S].

[9] AOAC 974.17，乳制品中黃曲霉毒素M1的測定[S].

[10] AOAC 980.21，牛奶和奶酪黃曲霉毒素M1的測定[S].

[11] GB/T 23212-2008，牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的測定[S].

[12] GB 5413.37-2010，乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定[S].

[13] 張 鵬，張藝兵，王 晶，等.牛奶及奶粉中黃曲霉毒素M1的快速測定[J].中國乳品工業，2002，30（6）：30-32.

[14] DB33/T 556-2005，乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定使用酶聯免疫吸附法[S].

[15] ISO 14675：2003（IDF186：2003），牛奶和牛奶制品.競爭酶聯免疫分析的標準化描述指南.黃曲霉毒素M1含量的測定[S].

[16] 鄧省亮，賴衛華，許暢.膠體金免疫層析法快速檢測AFTB1的研究[J].食品科學，2007，28（2）：232-235.

[17] 孫秀蘭，張銀志，湯 堅，等.金標免疫層析試條檢測樣品中AFTB1的誤差分析[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2007，35（7）：188-192.

[18] NY 1664-2008，牛乳中黃曲霉毒素M1的測定[S].