下向流曝氣生物濾池工藝處理藻漿壓濾液特性及微生物種屬分析

摘要：

對從太湖打撈的藍藻進行離心脫水后獲得藻漿壓濾液，其中含有大量藻類細胞液，N、P以及微囊藻毒素（MCLR）含量較高，如不經處理直接排放，必將引起二次污染。采用下向流曝氣生物濾池（BAF）工藝處理藻漿壓濾液，考察了對COD、氨氮、TN、TP、MCLR等污染物的去除效果。結果表明，當水力負荷為0.40 m3/（m2·h）時，出水COD、氨氮、TN、TP、MCLR平均去除率分別為73.4%、91.6%、39.6%、13.2%和88.3%。出水COD、氨氮達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準（GB 18918-2002）》中的一級A標準，MCLR低于《生活飲用水衛生標準（GB 5749-2006）》的限值。對BAF系統中微生物種屬進行分析，通過構建系統發育樹確定其優勢菌種分別為賴氨酸桿菌、氣單胞菌、芽孢桿菌、不動桿菌、無色菌、梭狀桿菌和假單胞菌，啟動期投加的藻毒素降解菌T1在BAF系統中生長良好并形成優勢菌種。

關鍵詞：

藻漿壓濾液；曝氣生物濾池；生物降解；DNA提取；菌種鑒定；系統發育

近20年來，由于水體富營養化導致湖泊和水庫水華頻發現象引起了公眾的關注。“三湖”之一的太湖水體富營養化嚴重，幾乎每年夏季爆發藍藻水華。2007年太湖藍藻事件以來，環太湖沿岸地區已相繼建設了數十個藍藻集中打撈點和藻水分離站，在每年的4月初至10月底這段藍藻爆發期間運行，處理方法主要是先用吸藻船打撈出藍藻藻液并輸送至分離站，再經氣浮后形成藻濃度更高的藻漿，藻漿經加藥絮凝后離心脫水，脫水后的固體物為泥渣，液體稱之為壓濾液。這種藍藻打撈及藻漿壓濾處理的方法為中國太湖等少數藍藻爆發地區特有的應急處理方法，國外未見報道，中國也未見藻漿壓濾液處理的報道。

張文藝，等：下向流曝氣生物濾池工藝處理藻漿壓濾液特性及微生物種屬分析

由于離心壓濾過程中大量藻細胞破損或死亡，使得藻細胞內物質釋放到水體中，造成藻漿壓濾液含有高濃度的N、P以及微囊藻毒素（microcystins，MCs）[1]。N、P是引起水體富營養化的主要因素之一，微囊藻毒素具有強肝毒性[24]和“三致”效應，這些污染物質若不經處理直接排放，會對周邊水體造成二次污染，藻水分離站對藍藻的分離處理也變成“去藻不去污”。

目前，對于藻漿壓濾液的研究還處于起步階段，未見相關研究報道。藻水分離站也僅進行回流處理，污染物質仍被間接排入水體，不能從根本上去除。因此，急需一種有效、快速的藻漿壓濾液的處理方法。下向流曝氣生物濾池（BAF）兼具物理過濾和生物降解作用，近年來在污水處理領域應用較多。本試驗采用該工藝處理藻漿壓濾液，考察COD、氨氮、TN、TP以及MC的去除效果，對BAF系統內生物膜進行分離純化，分析其中的優勢菌種，以期為藻漿壓濾液的有效處理提供技術參考。

1材料和方法

1.1試驗工藝流程

試驗工藝流程如圖1所示，下向流BAF試驗裝置有效體積1.68 L，有效高度1.0 m，內徑46.79 mm。填料為經NaCl改性的斜發沸石，沸石粒徑4～6 mm，孔隙率為52.47%。

圖1下向流BAF工藝流程示意圖

1.2試驗水質

試驗用水為常州市武進區藍藻污水處理站的藻漿壓濾液。為了保證良好的脫水效果，藻漿壓濾前加入了適量聚丙烯酰胺（PAM），故壓濾液中仍會殘留部分PAM，使壓濾液中藻類逐漸沉降，水質變清。試驗水質指標如表1所示。

1.3BAF的啟動與運行

啟動：反應器以0.15 m3/（m2·h）的濾速進行自然掛膜。初期采用生活污水，7 d后改進試驗用水。14 d后出水COD和氨氮去除率均大于70%且趨于穩定，表明掛膜成功。

為了提高下向流BAF對壓濾液中藻毒素的生物降解能力，在掛膜進水中加入1%的藻毒素降解菌菌液。菌液制備方法：將藻毒素降解菌接種于液體牛肉膏蛋白胨培養基，于30 ℃、100～120 r/min的條件下在恒溫搖床中培養24～48 h。藻毒素降解菌（被命名為T1）是由張文藝等[5]從太湖底泥中篩選所得，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會（登記入冊編號為：CGMCC4498）。

運行：運行期按水力負荷的遞增分為0.15、040、0.65、0.90 m3/（m2·h） 4個階段，每運行5 d反沖洗1次。采用氣水聯合反沖洗，方法是：先曝氣10 min，曝氣強度為40～50 m3/（m2·h）；再氣水聯合反沖洗10 min，進水流速為15～20 m3/（m2·h）；然后停止曝氣，用水反沖洗10 min；在一定的水力負荷條件下穩定24 h后進行取樣測定。

1.4水質分析方法

按中國國家標準法[6]：其中CODCr采用密閉消解法，氨氮采用蒸餾法，TN采用堿性過硫酸鉀消解分光光度法，TP采用鉬酸銨分光光度法。藻毒素（MCLR）的測定采用比克（Beacon，America）公司的微囊藻毒素檢測試劑盒（酶聯免疫法）。

1.5微生物的分離純化

待BAF穩定運行時，從反應器內取出100 mL填料置于三角瓶中，加入100 mL無菌水，置于120 r/min的搖床中，30 min后將其靜置5 min，并吸取上清液10 mL于100 mL液體培養基中，于30 ℃搖床轉速120 r/min下富集培養24 h。將富集培養后的菌液用無菌水進行倍比稀釋，吸取100 μL稀釋后的菌液至NB固體培養基，平板涂布后于30 ℃恒溫生化培養箱中進行培養。24～48 h后，進行菌落形態特征觀察，選擇性地分別挑選單一菌落進行平板劃線，重復劃線2～3次，獲得純化的單一菌株。

NB培養基配方：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g（僅配制固體培養基時加入）、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。滅菌條件：121 ℃，103 kPa，20 min。

1.6細菌計數

BAF運行穩定時，從反應器內取出100 mL填料于三角瓶中，加入100 mL無菌水，置于120 r/min的搖床中，30 min后吸取10 mL作為檢測水樣進行倍比稀釋直至10-8。吸取不同稀釋倍數的水樣1 mL至無菌培養皿，在每個培養皿中倒入冷卻至50 ℃左右的NB培養基20 mL，迅速轉動培養皿使之混勻，置水平位置靜止后使之凝固，倒置后于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h，選取適宜的稀釋倍數下的平板進行菌落計數，同一稀釋倍數計數3個取平均值。

1.7DNA提取及同源性分析

DNA提取采用上海捷瑞生物工程有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），菌種鑒定采用16S rDNA序列分析法。PCR正向引物為5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物為5-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3，體系50.0 μL（25.0 μL 2倍濃度含染料Taq Master Mix，10 μL正向引物，10 μL反向引物，1.0 μL DNA模板，22.0 μL雙蒸水）。反應條件為：預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，45 s；退火56 ℃，45 s；延伸72 ℃，1 min 50 s；最后延伸72 ℃，10 min；循環30次。

DNA的測序工作委托南京昆泰生物科技有限公司完成，測序結果通過DNAMAN軟件進行拼接并去除載體序列的影響，將獲得的16S rDNA菌株序列在NCBI（美國國家生物技術信息中心，http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）網上進行BLAST，與GenBank數據庫中的16S rDNA基因序列進行同源性比較分析。使用MEGA 5.0軟件采用鄰位連接法（Neighbour Joining）繪制系統發育樹，各分枝的重復性采用Bootstrap method程序分析，重復數為1 000，根據菌株的16S rDNA序列在系統發育樹中的地位判斷其分類歸屬。

2結果與分析

2.1COD去除效果

圖2為水力負荷分別為0.15、0.40、0.65、0.90 m3/（m2·h） 4個階段的COD去除效果。廢水生物處理過程中，由于水溫、溶解氧（DO）及進水COD波動，BAF出水指標總有少量波動；同一水力負荷下，COD去除率通常有10%左右的波動。為避免這種情況對分析造成的影響，取5組數據的平均去除率進行分析，以消除這種波動。由該圖可見，隨著水力負荷的增加，COD的去除率總體呈下降的趨勢。水力負荷從0.15 m3/（m2·h）增加為0.40 m3/（m2·h）時，平均去除率由77.13%降至73.39%；再增加至0.65 m3/（m2·h）時，去除率基本保持持平；增加至0.90 m3/（m2·h）時，去除率降為63.88%。水力負荷為0.15～0.90 m3/（m2·h）時，出水均能達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準（GB 18918-2002）》一級A標準（≤50 mg/L）。水中CODCr的去除主要依賴物理截留和微生物的分解作用。本試驗中CODCr去除率下降主要是因為隨著水力負荷的增大，污水與BAF中微生物接觸的時間縮短，水中有機物被降解的機率減小；另外，流速增大使得水對生物膜的沖擊力增大，生物膜易脫落，影響出水COD值。

圖2水力負荷對COD去除的影響

2.2氨氮去除分析

圖3為水力負荷分別為015、040、065、090 m3/（m2·h） 4個階段的氨氮去除效果。由該圖可見，水力負荷在0.15～0.90 m3/（m2·h）范圍內時，BAF反應器對氨氮都有比較好的去除效果，去除率均大于80%。水力負荷為0.15～0.65 m3/（m2·h）時，去除率相差不大，平均去除率為91.6%；水力負荷提高至0.90 m3/（m2·h）時，去除率輕微下降至835%。水力負荷為0.15～0.65 m3/（m2·h）時，出水氨氮能達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準（GB 18918-2002）》一級A標準（≤5 mg/L）。

圖3水力負荷對氨氮去除的影響

下向流BAF對藻漿壓濾液中氨氮的去除機理主要表現在如下3個方面：1）某些微生物如芽孢桿菌[7]，通過合成代謝將氨氮轉化為自身細胞成分從而減少水中的氨氮含量；2）氨氮在硝化細菌的作用下轉化為NO2-、NO3-；3）BAF填料—NaCl改性沸石對氨氮有物理吸附和離子交換的作用[810]。

2.3總氮去除分析

圖4為水力負荷分別為0.15、0.40、0.65、0.90 m3/（m2·h） 4個階段的總氮去除效果。由該圖可見，總氮的去除率呈先上升后下降的趨勢。水力負荷040 m3/（m2·h）時，平均去除率最高，為39.6%。分析認為，水力負荷0.15 m3/（m2·h）時，一方面，水力負荷低時，產生的NO2-和NO3-濃度就高，NO2-抑制了好氧反硝化細菌的活性，降低了對NO3-的轉化；另一方面，雖然污染物與微生物的接觸時間較長，但氣、水的傳質速率受到影響，不利于總氮的去除；水力負荷大于0.40 m3/（m2·h）后，氣、水的傳質速率已不再是影響總氮去除的因素，而由于與微生物的接觸時間縮短，去除率一直減小。

去除總氮主要有3個途徑：1）氮被填料表面微生物轉化為自身組成成分后隨著反沖洗水排出；2）BAF反應器具有同步反硝化作用[1113]，在反硝化菌的作用下NO2-和NO3-被轉化成N2釋放到空氣中；3）NaCl改性沸石對氮的物理吸附和離子交換作用。BAF反應器對總氮的去除率并不高，主要是缺少缺氧的環境，導致反硝化作用效率低，對此可增加一級BAF，為反硝化反應提供缺氧的環境。

圖4BAF連續運行對TN的處理效果

2.4總磷的去除分析

圖5為不同水力負荷條件下總磷的去除效果。由該圖可見，隨著水力負荷的上升，總磷的去除率一直下降，4個階段的去除率分別為16.5%、13.2%、9.2%、6.6%。總磷去除率下降的主要原因是水力負荷增加導致與微生物接觸的時間縮短。

圖5BAF連續運行對TP的處理效果

下向流BAF對藻漿壓濾液中TP的去除率較低，主要是由于BAF反應器的結構比較簡單，不能滿足生物除磷通常需要的厭氧、好氧交替進行的運行條件，其工作原理主要是好氧生物氧化和物理截留，故BAF反應器難以取得理想的生物除磷效果[14]。對此，可以在系統前增加厭氧反應池，以便聚磷菌在后續好氧段大量吸收磷，提高總磷去除率。

2.5藻毒素去除分析

藻毒素包括胞內藻毒素和胞外藻毒素。胞內藻毒素主要存在于藻細胞內，若將藻類去除，胞內藻毒素也隨之去除，而胞外藻毒素的去除主要依靠微生物降解。圖6為不同水力負荷條件下對藻毒素MCLR的檢測結果。由圖可見，隨著水力負荷的增加，出水MCLR逐漸增大，其去除率逐漸降低。水力負荷增加到0.40 m3/（m2·h） 時，MCLR去除率略有降低，增加到0.65 m3/（m2·h）時，去除率降低明顯，再增加到0.90 m3/（m2·h）時，去除率降低幅度減小。由試驗結果得出，出水MCLR濃度低于世界衛生組織頒布的《飲用水衛生準則》和中國《生活飲用水衛生標準（GB 5749-2006）》的限值（1.0 μg/L）。

圖6水力負荷MCLR去除的影響

試驗中BAF反應器對MCLR有較好的去除效果，主要因為：1）由于濾料的過濾作用，藻細胞被攔截，由此便去除了大部分胞內藻毒素；2）改性沸石可能存在對藻毒素的吸附作用；3）所投加的MC降解菌以及反應器內某些微生物對藻毒素的生物降解作用，這是胞外藻毒素降解的主要機制。

本試驗所投加的MC降解菌T1為張文藝等[5]從太湖底泥中篩得。研究表明，T1對初始濃度為250 μg/L的MCLR的去除率可達60%～70%。而本試驗中MCLR的濃度較低，為2.5 μg/L左右，且污水成分復雜，微生物可利用的碳源除MCLR外還有很多，在與多種碳源共存的條件下，MCLR的去除率仍達到75%左右，這說明T1對藻毒素的降解具有一定的專一性，不會因為其他碳源的存在而影響其對MCLR的利用。這一現象也說明了T1具有開發工程菌的價值，即用于處理成分復雜的實際污水時也可保持與靜態實驗相當的效果。

2.6微生物分離結果

經過分離純化，共分得15株菌株，其中革蘭氏陽性菌5株，陰性菌10株，對它們純培養得到的菌落形態特征及革蘭氏染色結果總結于表2。

2.7細菌計數結果

每毫升生物膜震蕩混合液中各菌數量見表2，各菌數量由多到少依次是：1#、3#、7#、5#、6#、2#、4#、9#、8#、10#、12#、15#、13#、14#和11#。其中1#～7#的數量均多于其他菌類，它們在下向流BAF處理藻漿壓濾液系統中占優勢，為它們分別編號為BL1～BL7，作為進一步研究的對象。

2.8優勢菌DNA鑒定

對BL1～BL7進行DNA提取和測序，將序列提交到GenBank數據庫，獲得BL1～BL7登錄號分別為JQ923439、JQ923440、JQ923441、JQ923442、JQ923443、JQ923444、JQ923445。將序列在GenBank中進行BLAST，與已知的有代表性序列進行比對，構建系統發育樹，結果如圖7所示。

圖7BAF系統中7株優勢菌的16S rDNA序列與GenBank中最相似序列的系統進化樹

同源性分析和系統進化表明，BL1與Lysinibacillus sphaericus（球形賴氨酸桿菌）最為相似；BL2與Bacillus fusiformis（梭狀桿菌）、BL3與Aeromonas veronii（維氏氣單胞菌）、BL4與Pseudomonas putida（惡臭假單胞菌）、BL5與Acinetobacter calcoaceticus（醋酸鈣不動桿菌）、BL6與Achromobacter xylosoxidans（木糖氧化無色桿菌）、BL7與Lysinibacillus sphaericus（球形賴氨酸桿菌）最相似。結合菌株的形態學和生理學特性，初步鑒定BL1為賴氨酸桿菌屬，BL2為梭狀桿菌屬，BL3為氣單胞菌屬，BL4為假單胞菌屬，BL5為不動桿菌屬，BL6為無色菌屬，BL7為芽孢桿菌屬。其中，BL1、BL2、BL7三株菌的親緣關系較近。

根據細菌計數結果，BAF反應器內BL1～BL7數量由多到少依次是：BL1、BL3、BL7、BL5、BL6、BL2和BL4。可見BAF反應器中占優勢菌類依次為賴氨酸桿菌、氣單胞菌、芽孢桿菌、不動桿菌、無色菌、梭狀桿菌和假單胞菌。其中，BL7與所投加的藻毒素降解菌T1（登錄號HQ877618.1）的相似性為99%，且同為芽孢桿菌屬。根據進化樹種的親緣關系，基本可以確定BL7與T1為同一種菌，即為T1后代。由此從遺傳學的角度證實了T1菌在BAF反應器內生長良好并形成了一定的優勢。

3結論

1）下向流BAF處理藻漿壓濾液的最佳的水力負荷為0.40 m3/（m2·h）。此條件下出水CODCr、氨氮、TN、TP、MCLR平均去除率分別為734%、91.6%、39.6%、13.2%和88.3%。出水COD、氨氮達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準（GB 18918-2002）》中的一級A標準，TP基本滿足《城鎮污水處理廠污染物排放標準（GB 18918-2002）》三級標準，MCLR低于《生活飲用水衛生標準（GB 5749-2006）》的限值。

2）通過分離純化，從下向流BAF反應器中共獲得15株菌株，分別命名為BL1～BL15，其中BL1～BL7為優勢菌株，通過DNA提取、PCR擴增、測序和構建系統發育樹，確定其種屬分別為芽孢桿菌、梭狀桿菌、氣單胞菌、假單胞菌、不動桿菌、無色菌和芽孢桿菌。

3）通過菌種數量統計和菌種鑒定表明，啟動期投加的藻毒素降解菌T1菌在BAF反應器內生長良好并形成了優勢菌種。

參考文獻：

[1]

肖興富，李文奇，劉娜，等.富營養化水體中藍藻毒素的危害及其控制[J].中國水利水電科學研究院學報，2005，3（2）：116123.

Xiao X F， Li W Q， Liu N， et al. Harmful effects of cyanobacterial toxins and their control in eutrophic freshwater [J]. Journal of China Institute of Water， 2005， 3（2）： 116123.

[2]Anna L， Lukasz K， Joanna G， et al. DNA damage and repair in human peripheral blood lymphocytes following treatment with microcystinLR [J]. Mutation ResearchReviews In Mutation Research， 2004， 559（122）： 131142.

[3]Geoffrey A C， Louise F M， James S M. Cyanobacterial toxins： risk management for health protection [J]. Toxicology and Applied Pharmacology， 2005， 203（3）： 264272.

[4]左金龍，崔福義，劉智曉.飲用水中藍藻毒素污染研究進展[J].環境污染治理技術與設備，2006，7（3）：813.

Zuo J L， Cui F Y， Liu Z X. A review of studies on pollution of cyanobacterial toxins in drinking water [J]. Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control， 2006， 7（3）： 813.

[5]張文藝，姚立榮，李秋艷，等.微囊藻毒素降解菌株及利用其降解MCLR的方法：中國，201110004314.5[P].20110817.

[6]國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法[M].4版. 北京：中國環境科學出版社，2002.

[7]郝桂玉，徐亞同，黃民生，等.芽孢桿菌脫氮作用的研究[J].環境科學與技術，2004，7（1）：2021.

Hao G Y， Xu Y T， Huang M S， et al. A study on denitrification of bacillus [J].Environmental Science and Technology， 2004， 7（1）： 2021.

[8]溫東輝，唐孝炎.天然斜發沸石對溶液中NH4+的物化作用機理[J].中國環境科學，2003，23（5）：509514.

Wen D H， Tang X Y. Mechanism for physiccal chemical actions of natural zeolite on NH4+ in solution [J]. China Environmental Science， 2003， 23（5）： 509514.

[9]林建偉，詹艷慧.氯化鈉改性沸石對氨氮的吸附作用[J].上海海洋大學學報，2010，19（5）：693697.

Lin J W， Zhan Y H. Removal of ammonium from aqueous solution using NaCl modified zeolite [J]. Journal of Shanghai Ocean University， 2010，19（5）： 693697.

[10]姜霞，周小寧，丁明玉，等.天然沸石及改性沸石去除低濃度氨氮的研究[J].環境科學研究，2008，21（5）：3842.

Jiang X， Zhou X N， Ding M Y， et al. Study on low concentration ammonia nitrogen removal by natural and modified clinoptilolites [J]. Research of Environmental Sciences， 2008， 21（5）： 3842.

[11]張文藝，陸麗巧，姚立榮，等.BAF反應器中好氧反硝化細菌的篩選分離及反硝化特性研究[J].中國農村水利水電，2011 （1）：5964.

Zhang W Y， Lu L Q， Yao L R， et al. Isolation of aerobic denitrification bacteria and denitrifying character of BAF bioreactor [J]. China Rural Water and Hydropower， 2011 （1）： 5964.

[12]鄧康，黃少斌，胡婷.曝氣生物濾池好氧反硝化脫氮的研究[J].環境科學，2010， 31（2）：29462948.

Deng K， Huang S B， Hu T. Study on aerobic denitrification in BAF [J]. Environmental Science， 2010， 31（2）： 29462948.

[13]章勝紅，陳季華，孫志國.曝氣生物濾池廢水深度處理同步硝化反硝化機理及影響因素[J].東華大學學報：自然科學版，2007，33（1）：126129.

Zhang S H， Chen J H， Sun Z G. Mechanism and affecting factors of simultaneous nitrification and denitrification in water deep treating using biological aerated filter（BAF） [J]. Journal of Donghua University： Natural Science， 2007， 33（1）： 126129.