基于亞甲基藍二氧化硅納米顆粒的細胞與活體成像

周冰　王玉雙　楊淑娜　何曉曉　王柯敏

摘要：采用反相微乳液法，制備了以亞甲基藍為內核材料的亞甲基藍二氧化硅納米顆粒，通過優化亞甲基藍的包裹濃度獲得熒光信號較強的納米顆粒，并初步考察了其用于Hela細胞標記與體內示蹤的可行性.通過MTT實驗考察了顆粒對細胞的毒性影響以及較為適宜的標記細胞的濃度，結果表明：當顆粒濃度為1 mg/mL時，細胞的存活率仍有80%左右.利用激光共聚焦顯微鏡考察了Hela細胞對顆粒的吞噬情況以及顆粒在細胞內的分布情況，結果表明，該顆粒能被Hela細胞吞噬且主要分布在溶酶體內.活體熒光成像結果顯示，尾靜脈注射該顆粒后，裸鼠全身都發射出近紅外熒光信號，隨著血液的循環，顆粒慢慢聚集在肝臟等器官中.以上結果表明，包裹亞甲基藍的二氧化硅納米顆?？梢杂糜诩毎臉擞浐腕w內示蹤成像.

關鍵詞：活體熒光成像；二氧化硅納米顆粒；亞甲基藍；納米顆粒

中圖分類號：O614124文獻標識碼：A

在各種組織和器官都保持完整的狀態下有效地觀察腫瘤細胞進入體內的分布、遷徙等生物學行為離不開細胞標記和體內示蹤技術，這對于臨床醫學上腫瘤的判斷、治療和手術等有著重要的意義.在各種細胞標記及活體示蹤技術中，熒光成像技術因其非侵入性及可重復性的特點而成為越來越多的研究者選擇的細胞標記及體內示蹤的方法[1].傳統的細胞體內成像主要依靠一些有機熒光染料，如熒光素異硫氰酸酯（FITC）、吲哚類菁染料等，它們由于具有較差的光穩定性及半衰期短等缺點，從而在進行高靈敏檢測及較長時間的細胞體內成像研究中受到限制.發展合適的標記成像探針已成為當前細胞標記與體內成像研究的熱點之一.

隨著納米技術的發展，基于功能化熒光納米材料的標記技術為細胞和活體標記示蹤研究提供了新的思路.目前標記、示蹤細胞和活體研究最多的納米材料主要有量子點[2]、熒光納米顆粒[3]等.相對于傳統熒光染料而言，量子點具有較好的量子產率、大的Stokes位移、好的抗光漂白能力與組織穿透力[4].但是，使用量子點進行活體成像的最大挑戰在于量子點長期毒性的不確定性[5].二氧化硅熒光納米顆粒因合成過程更為簡便，對細胞的毒性要弱，生物相容性更好，可作為藥物載體達到細胞治療的目的等優勢成為一種理想的成像探針并已經在生物醫學成像研究中得到廣泛應用[6].如本研究小組在二氧化硅熒光納米顆粒的制備和應用研究方面開展了系統的工作.利用油包水反向微乳液方法成功制備出多種包裹不同熒光染料（如RuBpy，Cy5.5和FITC等）的二氧化硅熒光納米顆粒，這些納米顆粒在分子和細胞層面的成像和檢測中得到了很好的應用[7-10].然而，針對活體這個特殊的研究對象，由于動物體在可見光的激發下自身組織會有較強背景熒光，嚴重干擾目標探針信號的準確度和靈敏度，而在近紅外光區，生物組織對光的吸收較少，光的組織穿透力強，成像信背比相對較高[11-12]，從而使得近紅外二氧化硅熒光納米顆粒成為細胞標記與活體成像的理想材料之一.

目前所報道的包裹近紅外熒光染料種類較少而成本相對較高，亞甲基藍是一種廉價的近紅外染料，并且已用于生物樣品的熒光分析中[13].本文采用反相微乳液法，制備以亞甲基藍為內核材料的亞甲基藍二氧化硅納米顆粒，通過優化亞甲基藍的包裹濃度獲得熒光信號較強的納米顆粒.通過MTT實驗來考察顆粒對細胞的毒性效果以及較為適宜的標記細胞的濃度.利用激光共聚焦顯微鏡來考察Hela細胞對顆粒的吞噬情況以及顆粒在細胞內的分布情況，在此基礎上，進一步通過活體熒光成像系統考察顆粒體內示蹤成像的可行性.

1.2.7亞甲基藍二氧化硅納米顆粒用于活體成像

在顆粒進行Hela細胞示蹤成像之前，首先對顆粒的活體熒光成像情況進行考察.具體步驟為：取兩組裸鼠，每只裸鼠在實驗時，肌肉注射50 μL的異丙嗪，30 min后再按照80 mL/20 g劑量進行腹腔注射濃度為2%戊巴比妥鈉，等到完全麻醉后從尾靜脈注射12.5 mg/mL的亞甲基藍二氧化硅納米顆粒 200 μL，取不同的時間點對小鼠進行活體成像，觀察體內熒光分布變化情況.活體成像系統采用635 nm的紅光激發，680 nm～800 nm收集，曝光時間1 000 ms.（所有動物實驗操作均遵守湖南省實驗動物中心實驗動物使用和保護規章制度，許可證：NO.SYXK（湘）2008-0001）.共重復3次.取第2組裸鼠作為對照，不注射亞甲基藍二氧化硅納米顆粒，重復3次.實驗中所使用的裸鼠均為4～6周齡，體重在15～20 g之間，裸鼠用屏蔽的動物隔離器飼養，溫度控制在28 ℃左右，濕度在40%左右，飼養條件完全按照裸鼠飼養條件進行飼養.

為了對活體熒光成像結果的準確性進行證實，在尾靜脈注射亞甲基藍二氧化硅納米顆粒90 min后對裸鼠進行解剖，取出其部分器官進行熒光成像.將未注射的裸鼠同時解剖作為對照，同樣對解剖后的裸鼠和取出的相應器官進行熒光成像.器官的擺放按照從上到下、從左至右的順序依次為：無食物殘渣的小腸、膀胱、腎臟、脾臟、心臟、肺、皮膚、肝臟、肌肉、含食物殘渣的大腸.

為了進一步驗證活體熒光成像結果，對裸鼠、亞甲基藍二氧化硅納米顆粒、裸鼠飼料同時進行活體熒光成像考察.活體成像系統采用615～665 nm的紅光激發，680～800 nm收集，曝光時間200 ms.

2結果與討論

2.1亞甲基藍二氧化硅納米顆粒的制備及亞甲

基藍濃度的優化

通過反相微乳液法制備了亞甲基藍二氧化硅納米顆粒.為了考察亞甲基藍是否包裹進二氧化硅納米顆粒內，采用紫外可見分光光度計來考察純亞甲基藍染料和亞甲基藍二氧化硅納米顆粒在水相中的吸收光譜，采用活體成像儀測定亞甲基藍二氧化硅納米顆粒的熒光發射光譜.結果如圖1所示，純亞甲基藍染料的紫外最大吸收峰約為650 nm，制備成亞甲基藍二氧化硅納米顆粒的最大吸收峰藍移至620 nm左右，沒有很大改變.通過對顆粒的熒光發射光譜測定可以看出，亞甲基藍二氧化硅納米顆粒的最大發射峰大約在710 nm這些吸收峰和發射峰都在近紅外區域，說明已成功制備了亞甲基藍二氧化硅納米顆粒.這為能更靈敏的進行細胞標記和

活體示蹤成像奠定了一定的基礎.從顆粒的熒光成像圖可以看出亞甲基藍二氧化硅納米顆粒具有較強的熒光強度.此結果表明亞甲基藍二氧化硅納米顆粒能夠為體內示蹤成像提供較好的熒光信號.

基于以上的實驗結果，可以得出本文制備的亞甲基藍二氧化硅納米顆?？梢杂糜诩毎麡擞浖绑w內示蹤成像，但要想進行高靈敏的熒光成像，必須要解決裸鼠食物熒光信號對目標信號的干擾.因此在設計近紅外熒光探針來進行細胞標記及活體成像研究中，不僅要考慮降低可見光區裸鼠的組織自發熒光還要考慮降低近紅外光區裸鼠食物的熒光信號.

3 結論

本文通過優化亞甲基藍的包裹濃度獲得了熒光信號較強的亞甲基藍二氧化硅納米顆粒，并初步考察了該顆粒的Hela細胞標記成像和活體熒光成像.結果表明，包裹亞甲基藍的二氧化硅納米顆?？梢杂糜诩毎麡擞浐腕w內示蹤成像.但是由于在相同的成像條件下，裸鼠食物的熒光信號也很強，干擾了成像的靈敏度.因此，發展一種能同時克服裸鼠組織自發熒光與裸鼠食物熒光信號的成像探針對于進行高靈敏的細胞標記及體內示蹤成像具有重要的意義，這有待于進一步的研究.

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