16S rRNA基因測序法鑒定豬多殺性巴氏桿菌的研究

丁曉

摘要：對66株豬多殺性巴氏桿菌的鑒定結果表明，PCR是一種快速、特異、靈敏的病原檢測方法。應用能夠擴增大多數原核生物16S rRNA基因的通用引物，對豬多殺性巴氏桿菌疫苗株（EO630）和野外分離株的16S基因rRNA進行PCR擴增，以期為分子水平上準確地鑒別豬巴氏桿菌提供依據。

關鍵詞：多殺性巴氏桿菌；16S rRNA；PCR

中圖分類號：S852.61+2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）05-0005-02

多殺性巴氏桿菌是一種廣泛存在的感染致病菌，在我國規模化養殖場常有染病和發病。目前，在獸醫臨床上對該病的確診仍普遍采用傳統的病原分離方法，即通過對細菌進行純培養分離，然后從形態學、生理生化反應特征以及免疫學特性等方面加以鑒別，以確定細菌的種屬和血清型。雖然這種方法能取得可靠的鑒定結果，但存在操作繁瑣，耗時長等不足。近年來，唐先春等[1]建立了豬多殺性巴氏桿菌的PCR檢測方法，對66株多殺性巴氏桿菌的鑒定結果表明，PCR檢測是一種快速、特異、靈敏的病原檢測方法。管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法對禽多殺性巴氏桿菌的分離株及我國的代表性疫苗株進行了鑒定研究，結果表明2株分離菌與對照的強弱毒株之間的同源性為100%。

該試驗應用能夠擴增大多數原核生物16S rRNA基因的通用引物，對豬多殺性巴氏桿菌疫苗株（EO630）和野外分離株的16S rRNA基因進行PCR擴增，以期為分子水平上準確地鑒別豬巴氏桿菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。Premix-Taq酶和DNA Marker均為TaKaRa公司產品。

1.2 儀器

電熱恒溫培養箱、冰箱、無菌操作臺、電泳儀及紫外分析儀、PCR儀。

1.3 培養基

血清肉湯：稱取營養瓊脂粉末33 g加入1 000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝高壓滅菌（121 ℃，30 min）后，冷卻到50～60 ℃，按3%的比例加入新生小牛血清，低溫保藏備用。

血液瓊脂平板：稱取營養瓊脂粉末33 g加入 1 000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝，高壓滅菌（121 ℃，30 min）后，冷卻到50～60 ℃，按5%～6%的比例加入無菌脫脂纖維兔鮮血，然后制成平板低溫保藏備用。

麥康凱瓊脂平板：稱取麥康凱瓊脂粉末33 g加入1 000 mL蒸餾水，加熱至全部溶解，121 ℃高壓滅菌30 min后，制成平板，低溫保藏備用。

1.4 菌株來源

豬巴氏桿菌標準疫苗株（EO630），為廣東省農科院獸醫所提供。

豬巴氏桿菌野外分離株，為佛山科學技術學院傳染病實驗室提供。

1.5 基因組DNA的抽提

將血液瓊脂培養基上的野外分離株用無菌生理鹽水制成的細菌洗液和豬巴氏桿菌疫苗株，用UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒抽提細菌基因組DNA。操作步驟如下：

（1）取200 μL制備好的樣品，加入400 μL Digestion Buffer混勻，再加入3 μL Proteinase K混勻，55 ℃保溫5～10 min。

（2）加入200 μL無水乙醇混勻，然后用1 mL Tip 頭將樣品全部轉移到套放于2 mL 收集管內的UNIQ-10柱中。

（3） 8 000 r/min室溫離心1 min。

（4） 取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的全部廢液，將柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solition，10 000 r/min，室溫離心30 s。

（5）重復步驟（4）一次。

（6）取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的全部廢液，將柱放回收集管中，10 000 r/min，室溫離心15 s，以除去殘留Wash Solution。

（7） 將柱放入新的潔凈1.5 mL離心管中，在柱中央加入50 μL Elution Buffer，室溫放置2 min。

（8）10 000 r/min，室溫離心1 min。離心管中的液體即為基因組DNA。樣品可以4 ℃或～20 ℃保存。

1.6 引物

使用能夠擴增大多數原核生物16S rRNA 基因序列的通用引物，該引物同時能夠擴增出豬附紅細胞體和貓血巴爾通氏體的16S rRNA基因序列。引物由上海博亞公司合成。引物序列如下：

上游引物：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

下游引物：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.7 PCR擴增

PCR反應在PCR儀上進行，反應體系的總體積為50 μL，其中Premix-Taq 酶25 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各1μL，模板為5 μL ，然后加dd H2O至50 μL 。擴增程序如下：94 ℃預變性10 min；94℃變性3 min，50 ℃退火1 min ，72 ℃延伸2 min ，32個循壞；最后72 ℃延伸7 min。陽性對照為鏈球菌疫苗株，以蒸餾水為陰性對照。其他反應程序同上。取10 μL PCR 產物，經溴化乙錠染色的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射臺上觀察。

1.8 PCR產物的測序

將試驗獲得的兩株豬巴氏桿菌PCR產物直接送上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。

1.9 序列同源性分析

進入Internet登錄美國國家生物技術信息中心（NCBI）站點后，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTn”程序，將序列與GenBank中已知的各種微生物序列進行相似性搜索，尋找同源核苷酸序列，確定其種類。采用DNAssist軟件的多序列比對程序對試驗獲得的疫苗株和分離株的序列進行比較。

2 結果與分析

2.1 分離株的分離鑒定結果

分離株在麥康凱培養基上不生長，在鮮血瓊脂培養基上生長良好，菌落形態均為露珠狀、邊緣整齊、有光澤的灰色圓形菌落，無溶血現象。在血清肉湯中培養，開始輕度渾濁，4～6 d后液體變清朗，管底出現粘稠沉淀，振搖后不分散，表面形成菌環。鏡檢觀察形態一致，為球桿狀或短桿狀菌，兩端鈍圓、無鞭毛、不形成芽孢、兩極著色、革蘭氏染色陰性。

2.2 PCR擴增結果

從豬巴氏桿菌的分離株和疫苗株中抽提細菌基因組DNA，用通用引物進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳，擴增出大小約為1.5 kb的DNA片段，以鏈球菌疫苗株為陽性對照的PCR擴增，也得到了相似的條帶。以蒸餾水為陰性對照沒有出現特異性條帶。

2.3 PCR測序結果

經上海生工生物工程技術服務有限公司測序，獲得豬巴氏桿菌疫苗株和野外分離株16S rRNA 基因核苷酸序列。

2.4 同源性分析

接入Internet進入美國國家生物技術信息中心（NCBI）站點，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTn”程序，將序列與GenBank中已知的各種微生物序列進行相似性搜索，尋找同源核苷酸序列，BLASTn結果顯示，試驗所獲得的巴氏桿菌疫苗株和野外分離株的序列與GenBank中多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因序列同源性最高，達98%。用DNAssist軟件的多序列比對程序試驗獲得的疫苗株和分離株的對試序列進行比較，結果顯示，豬多殺性巴氏桿菌疫苗株（EO630）和野外分離株的16S rRNA基因的同源性為達97.5%。

3 小結與討論

（1）多殺性巴氏桿菌野外分離株經常規培養、鏡檢、生化試驗可以初步斷定為多殺性巴氏桿菌，該試驗對多殺性巴氏桿菌疫苗株和野外分離株用試劑盒抽提基因組DNA，按照試驗使用的引物和PCR擴增系統進行目的片段的擴增，對擴增產物進行序列測定和分析，結果證明，試驗建立的PCR擴增方法能成功地擴增出巴氏桿菌的16S rRNA基因，適合于進行多殺性巴氏桿菌的分子鑒定。

（2）多殺性巴氏桿菌是豬肺疫的病原菌。豬肺疫是一種危害嚴重的疾病，死亡率較高。該病主要引起成年豬的急性敗血癥，有時也可導致慢性呼吸道癥狀，致使豬群生長緩慢，嚴重影響經濟效益。

rRNA按沉降系數分3種，分別為5S、16S和23S。16S rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因組中，其基因序列由保守區和可變區組成，兩者互相交錯排列。編碼rRNA基因與細菌整個基因組的變化相比，有高度的保守性。現有細菌其祖先的某些痕跡仍留在其核苷酸序列中，這種痕跡為細菌的系統進化研究提供了可能。因此，有人將rRNA稱為細菌的“化石”[3]。16S rRNA基因是目前最常被選用的分類鑒定基因，不同科、屬、種間的細菌16Sr RNA基因同源性可達97%以上[4]。

管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法對禽多殺性巴氏桿菌的分離株及我國的代表性疫苗株進行了鑒定研究，結果表明2株分離菌與對照的強弱毒株之間的同源性為100%。本試驗只進行了2個豬多殺性巴氏桿菌株的16S rRNA基因的序列分析，雖然結果不能進一步揭示2株巴氏桿菌是否為同一個亞種，但從結果可以看出，豬多殺性巴氏桿菌疫苗株和野外分離株的16S rRNA基因的同源性為97.5%，說明豬多殺性巴氏桿菌疫苗株和野外分離株的16S rRNA基因存在一定差異。

（3）試驗測定的豬多殺性巴氏桿菌疫苗株是目前廣東豬群廣泛使用的弱毒菌株，由于16S rRNA基因是一個具有高度保守性的基因，疫苗株和野外分離株之間16S rRNA基因序列的差異提示，疫苗株和野外流行的部分毒株之間的遺傳特性存在著一定程度的差異，這種差異是否能解釋豬多殺性巴氏桿菌疫苗免疫接種以后，在某些豬群仍然有豬肺疫病的散發，尚需要進行進一步的研究。

參考文獻：

[1] 唐先春，吳 斌，陳煥春.豬多殺性巴氏桿菌PCR檢測方法的建立及其應用[J].中國獸醫科技，2004，34（2）：46-48.

[2] 管 宇，沈志強，劉吉山，等.應用16S rRNA基因測序法鑒定禽多殺性巴氏桿菌的研究[J].中國預防獸醫學報，2003，25（5）：349-352.

[3] 騰懿群.16S rRNA基因對細菌感染的分子生物學研究[J].國外醫學流行病學傳染病學分冊，1997，24（4）：60-63

[4] JONAS D，ROSENBAUM A，WEYRICH S，et al.Enzyme linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of Legionella in bronchoalveolar fluid[J]. J Clin Microbiol，1995，33（5）：1247-1257.