超低溫保存對貴州酥李種子生理生化特性的影響

陳紅　韓曉瑩

摘 要：以貴州酥李種子為試驗材料，探討了超低溫保存不同解凍方式對酥李種子生理生化特性的影響。結果表明，慢速解凍和快速解凍降低脫氫酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性以及增加丙二醛（MDA）含量，而緩慢解凍中脫氫酶活性和丙二醛含量均無顯著性變化，其余酶活性降低。因此，適宜酥李種子超低溫保存程序為緩凍緩解。

關鍵詞：酥李種子；超低溫保存；生理生化指標

中圖分類號： S662.3 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.001

酥李為貴州優良地方品種，目前主要以大田種植保存為主，但近年來，頻繁受到自然災害的影響，部分優良酥李單株逐漸消失。近些年發展起來的超低溫保存為種質資源的長期保存提供了技術支持。目前，已廣泛應用于柑橘[1]、鐵皮石斛[2]、七葉樹[3]、杏[4]、板栗[5]等種子的超低溫保存。本試驗以貴州酥李成熟種子為材料，研究超低溫保存過程中不同解凍方式對其生理生化特性的影響，篩選出適宜的解凍方式，以期為酥李種子超低溫保存技術程序的建立提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為貴州酥李成熟種子，采自貴陽市。采后于室溫下自然風干，測定含水量為10.85%。試驗中選擇10%二甲基亞砜（DMSO）作為冷凍保護劑，以不經液氮處理的為對照（CK）。每個處理25粒，3次重復。

1.2 冷解凍程序

試驗中冷凍方式均采用緩慢冷凍，解凍方式采用緩慢解凍、慢速解凍、快速解凍。具體參照陳禮光等[6]方法。

1.3 測定指標及方法

脫氫酶活性測定采用TTC染色法，α-淀粉酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外分光光度法。

2 結果與分析

2.1 不同解凍方式對脫氫酶活性的影響

脫氫酶活性的強弱，與種子的呼吸作用強度、代謝能力強弱及種胚損傷程度有關。同時，還與種子的萌發呈正相關。由圖1可知，采用緩解方式種胚的脫氫酶活性為34.46 μg·g-1·mL-1，從數值上看，甚至比對照種胚的脫氫酶活性（32.74 μg·g-1·mL-1）略高，與自然狀態下種胚脫氫酶活性最接近，表明超低溫保存后種胚的活力與自然狀態下的種胚活力相似。采用慢解和快解方式種胚的脫氫酶活性與對照相比，均呈下降趨勢。而種胚慢解與快解之間脫氫酶活性沒有達到顯著性差異，但都與對照達到了顯著性差異，故不同處理方式對種子的脫氫酶活性產生了不同的影響。

2.2 不同解凍方式對α-淀粉酶活性的影響

α-淀粉酶在種子萌發生長過程中起著重要的作用，它將種子內貯藏大分子物質淀粉分解為可吸收利用的小分子物質，其活性的高低對種子萌發生長過程中的能量和各種中間產物的供應有很大影響。不同的解凍方式對種胚的α-淀粉酶的活性影響不同。分析圖2種胚的α-淀粉酶活性，尤以采用快解方式的α-淀粉酶活性最低，為0.58 mg·g-1·min-1，降幅最大，對照種胚的α-淀粉酶活性為0.89 mg·g-1·min-1，幾乎達到其1.5倍。緩解與慢解中的α-淀粉酶活性沒有達到顯著差異水平，但均與對照呈顯著性差異。在不同的解凍方式中，α-淀粉酶活性大小為緩解>慢解>快解。

2.3 不同解凍方式對丙二醛（MDA）含量的影響

有關研究表明，在低溫冷害條件下，活性氧自由基的積累超過閾值時，膜脂過氧化就會發生，反應中還會伴隨著丙二醛的產生，丙二醛可與蛋白質結合使酶鈍化，與核酸結合引起染色體變異[7]。因此，丙二醛的含量可以衡量種子的受損程度。試驗表明，液氮保存對種子的膜結構也會產生不同程度的傷害。由圖3可知，采用快解方式的種胚中丙二醛含量最高，達2.34 μmol·g-1，幾乎為對照的3.5倍。說明此種解凍方式對種子的傷害非常嚴重，其次是慢解為0.69 μmol·g-1。而采用緩解方式的種胚丙二醛含量與對照無明顯差別，可能此時種胚沒有受到明顯的損傷。對試驗材料的傷害程度依次為快解>慢解>緩解。

2.4 不同解凍方式對抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 SOD是植物體內清除自由基最重要的酶，一般來說，其活性大小能夠作為反映細胞膜系統完整性的指標之一。對照中SOD的活性為160.53 U·g-1。從圖4中可以看到，與對照相比，采用不同的解凍方式處理，種胚的SOD活性均有不同程度的下降。采用快速解凍處理后的種胚SOD活性均比其他2種處理方法低，為115.29 U·g-1，僅為對照的7/10，說明其胚細胞膜系統所受的低溫傷害較嚴重，胚活力下降，其次是慢解，活性為134.75 U·g-1。同時，各解凍方式之間的SOD活性差異也很大，其大小依次為緩解>慢解>快解。

2.4.2 對過氧化物酶（POD）活性的影響 過氧化物酶是種子很重要的抗逆酶，早在20世紀初就已經用POD活性來衡量種子活力，高活力種子抗逆性酶活力強[7]。圖5中種胚POD活性與對照中的POD活性491.63 U·g-1·min-1相比，不同解凍處理的種胚POD活性均呈下降趨勢，尤以種胚快解的POD活性最低，為380.65 U·g-1·min-1。而緩解與慢解種胚的POD活性沒有達到顯著性差異，分別為431.71 U·g-1·min-1和419.96 U·g-1·min-1，但都與對照達到了顯著性差異。

2.4.3 對過氧化氫酶（CAT）活性的影響 與SOD、POD一樣，CAT也是細胞內重要的抗逆酶，可以清除細胞內多余的過氧化氫，減輕其對膜脂的傷害能力。由圖6可知，各解凍方式對種胚CAT活性的影響不同。所有解凍處理中，采用快速解凍方式的CAT活性最低，為1.27 U·g-1·min-1，降幅最大，與對照及各處理間均達到了顯著差異水平。采用緩解方式的CAT活性為2.40 U·g-1·min-1，慢解方式的CAT活性為2.27 U·g-1·min-1，兩者之間并沒有達到顯著性差異。

3 討 論

本試驗通過對種子的酶活性及丙二醛含量等方面的測定，探討了超低溫保存對貴州酥李種子生理生化特性的影響。脫氫酶活性是檢驗種子活力的方法之一，脫氫酶活性的下降，導致種子萌發力的下降。緩解中脫氫酶活性比對照略高，說明超低溫保存后的種子細胞還原能力提高，可能此時尚未對酥李種子造成嚴重的冷凍傷害。陳禮光等[8]的研究表明，在緩凍緩解方式下，能夠提高錐栗離體胚脫氫酶活性。超低溫保存對種子的某些性能具有一定的促進作用。在杉木種子[9]和南瓜種子[10]的保存研究中，超低溫保存能夠提高其萌發力，而本試驗中緩慢冷凍方式種子的活力并沒有提高，對于快速冷凍和慢速冷凍是否有助于酥李種子活力的提高，有待深入的探索。

在溫度發生驟變時會影響到種子內部的生理活動，尤以硬實種子最明顯，內果皮會炸裂，但是如果采取合理而有效的冷凍方式和解凍方式，并輔以冷凍保護劑的處理，便可有效地減小因為溫度的急劇變化對種子造成的傷害，使種子保持較高的活力。有研究表明，閩粵栲離體胚超低溫保存時采用冷凍保護劑為15%二甲亞砜+10%蔗糖+10%聚乙二醇的快凍快解組合方法最佳[6]。史鋒厚等[11]認為超低溫貯藏油松種子時以10%二甲基亞砜作為冷凍保護劑，采用快速冷凍、慢速解凍的處理組合最佳。本試驗發現緩解方式明顯優于其他幾種解凍方式，脫氫酶及SOD均比其他幾種解凍方式種子的活性高，且用自然含水量的種子進行超低溫保存，種子的萌發力未降低。在幾種解凍方式中，不同解凍速度對保存效果影響不同，導致的低溫傷害程度也不同，雖然抗氧化酶活性均有不同程度的下降，但是尤以快速解凍方法對種子的傷害最大，丙二醛含量最高。綜合分析可知，適合自然含水量狀態下酥李種子超低溫保存的處理組合為緩凍緩解。

參考文獻：

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