郁李花粉生活力及貯藏特性的研究

何莉　賈文慶

摘 要：以郁李花粉為試材，利用離體培養法、碘-碘化鉀染色法、醋酸洋紅染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法對花粉生活力進行測定，并研究了不同貯藏條件對花粉萌發的影響。結果表明，培養基中添加不同濃度的蔗糖和硼酸對花粉的萌發有促進作用，郁李花粉萌發的最適培養基為：15%蔗糖+0.004%硼酸，萌發率達41.52%。花粉生活力隨貯藏時間的延長而下降，不同的貯藏條件對其有顯著的影響，適當的低溫可有效延長花粉貯藏時間。其中-80 ℃萌發率最高，為最佳貯藏方法。

關鍵詞：郁李；花粉；生活力；貯藏

中圖分類號：S662.3 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.002

郁李（Prunus japonica Thunb）為薔薇科梅屬灌木，桃紅色寶石般的花蕾，繁密如云的花朵，深紅色的果實，美麗可愛，是園林中重要的觀花、觀果樹種 [1]。

花粉在有性繁殖中傳遞著雄性親本的遺傳信息。在農業和林業的常規育種中，為了進行人工輔助授粉或雜交授粉，需要早期采集和貯存花粉。尤其是在雜交育種工作中，研究花粉的生活力和育性是必不可少的基礎性工作[2]。保存花粉的活力是解決親本花期不一致或遠距離雜交的主要途徑。花粉生活力的鑒定是采集和貯存花粉必須的檢測內容。不同類群植物花粉在自然條件下的壽命、花粉的適宜貯存、營養條件以及花粉生活力的適宜測定方法均有所差異[2]。掌握適宜的培養、貯存方法及生活力檢測的方法對于提高植物育種效率具有較高的實際應用價值。

國內外對郁李的研究主要集中在栽培[1]、園林應用[3]、病蟲害防治[1]等方面，對郁李花粉生活力及其貯藏特性研究尚未見報道。為此，筆者通過用染色法、培養基萌發法對郁李花粉生活力進行了探討，并研究了不同貯藏條件及時間對其花粉生活力的影響，以期為郁李的引種、育種提供依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

郁李花粉采于河南科技學院院內。于晴天上午10：00采集，選取含苞待放的花朵，帶回實驗室后去除花瓣取花藥于培養皿內，置于（25±1） ℃的培養箱散粉12 h后，收集花粉備用。

1.2 最佳培養基篩選

采用2因素（蔗糖、硼酸）完全隨機試驗，蔗糖為0，10%，15%，20%，25%；硼酸濃度為0，0.001%，

0.002%，0.003%，0.004%，0.005%。培養基均添加瓊脂8 g·L-1，pH值調至5.8。

將培養基倒入凹玻片的凹處，與蓋玻片表面平行，待冷卻后，用頭發絲蘸取花粉均勻散于培養基上，將凹玻片置于鋪有兩層濕濾紙的培養皿中，在（25±1） ℃的培養箱中培養2，4，8，16 h后，觀察統計出萌發的花粉數和未萌發的花粉粒數。計算萌發率，每處理3次重復，每重復統計花粉數不少于100粒。

萌發率=萌發花粉粒數/總花粉粒數×100%

1.3 花粉染色法

1.3.1 I2-KI染色法 用頭發絲蘸取花粉置于載玻片上，加一滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，靜置3～4 min后置于顯微鏡下觀察。染色后有生活力的花粉呈藍色，無生活力的花粉無色。觀察3張載玻片，每個載玻片取3個視野進行觀察，計算有生活力的花粉所占百分率的平均值。

1.3.2 TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法 用上述方法蘸取花粉置于載玻片上，加1滴0.5%TTC溶液，蓋上蓋玻片，置于30 ℃恒溫箱中，10～15 min后鏡檢。凡被染紅色的花粉活力強，淡紅色次之，無色者為沒有活力或不育花粉。觀察3張載玻片，每張載玻片取3個視野進行觀察，計算有生活力花粉所占百分率的平均值。

1.3.3 醋酸洋紅染色法 蘸取花粉置于載玻片上，加一滴醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片，立刻置于顯微鏡下觀察。凡被染成紅色的均為有生活力的花粉。

1.4 貯藏方法

花粉采集陰干后，裝入離心管放在以下4種環境條件下貯存：A.室溫；B. 4 ℃；C. -20 ℃；D.-80 ℃。貯藏5，10，15，20，25 d后，取出花粉置于1.2所得最佳培養基培養，16 h后觀察統計花粉萌發率。花粉耐貯藏力是以待測花粉活力保持時間即待測樣活力降為零的時間長度來表示[4]。

2 結果與分析

2.1 離體培養法對郁李花粉萌發的影響

表1表明，花粉在單一蔗糖或硼酸的培養基上萌發率很低，其中20%蔗糖單獨使用時最好，花粉的萌發率為21.17%，硼酸單獨使用時以0.004%最好，萌發率為15.59%，但試驗統計發現，20%蔗糖+0.004%硼酸培養基并不是花粉萌發的最適培養基。在完全隨機試驗中，蔗糖、硼酸、蔗糖×硼酸差異都極顯著。表1表明，蔗糖和硼酸最佳的培養基為：15%蔗糖+0.004%硼酸，花粉萌發率最高，發芽率達41.52%。

2.2 TTC染色法、I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法

觀察發現，用碘-碘化鉀染色后，染成深藍色（即有生活力）的花粉有24.6%，黃褐色（即缺失生活力）的花粉為75.4%；而TTC染色后，所觀察的視野中郁李的花粉粒均未染色；醋酸洋紅染色后，呈深紅色（即有生活力）的花粉粒達89.2%，淺紅（無生活力）的花粉粒為11.8%。以上3種染色方法均與離體培養法最佳培養基得出的萌發率（41.52%）相比，差距很大。因此，醋酸洋紅染色法、碘-碘化鉀法、TTC法均不易作為測定郁李花粉生活力的染色劑。

2.3 不同貯藏環境條件對花粉生活力的影響

由表2可知，不同貯藏條件對花粉生活力有明顯的影響，花粉萌發率隨著貯藏時間的延長而下降。花粉在常溫下保存生活力明顯下降，所以花粉不適宜在常溫條件下保存（圖1-1）。在低溫（4 ℃和-20 ℃）條件下，花粉生活力呈較小幅度平穩下降，但整體上萌發率不高，到第25天花粉生活力僅為3.73%和6.35%（圖1-2，圖1-3）。在超低溫（-80 ℃）條件下，花粉生活力的變化趨勢非常緩和，花粉的萌發率明顯高于其他環境條件，貯藏25 d后萌發率還可達到17.49%（圖1-4）。綜合比較，郁李花粉貯藏的最佳方式為超低溫（-80 ℃）貯藏，可較長時間保持花粉生活力，室溫環境不利于花粉的長期貯藏。

3 結論與討論

3.1 花粉生活力鑒定的方法

目前，關于花粉生活力鑒定的方法很多，主要有顯微鏡形態觀測、染色法、培養基發芽法[5]，其中染色法又有TTC染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法等。利用染色法進行花粉生活力測定具有快速簡便的優點，但受花粉自身特性（如花粉壁的厚薄，花粉外壁的組成物質，花粉內各種酶活性的強弱等）的影響較大，因此，不同的染色法只適合某些植物花粉生活力的測定。趙統利等[6]對百合花粉生活力測定也認為，I2—KI法不能準確表示花粉的活力。本試驗測得的數據也證明了這一點。而培養基發芽法應用較為普遍，并且其測定結果比較精確可靠[7-9]，但不同植物花粉萌發的時間不同，適合萌發的條件也不同[7-10]。筆者采用培養基發芽法來測定郁李花粉的生活力。

3.2 最佳培養基篩選

有關研究認為，在培養基里添加適宜濃度的蔗糖和硼酸有利于花粉的萌發，蔗糖一方面為花粉萌發和花粉管的生長提供營養，另外還起著維持花粉與培養液之間滲透平衡、避免花粉及花粉管破裂的作用[11]。硼酸可以促進糖的吸收和代謝，與糖結合能極大地提高花粉的萌發率，增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質的合成[12]，利于花粉管的建造[13]。本試驗分別采用不同濃度的蔗糖和不同濃度的硼酸進行試驗，得出最適合郁李花粉萌發的蔗糖濃度為20%，硼酸濃度為0.004%，萌發率分別為21.17%和15.59%。但通過完全隨機試驗后，確定出最適合郁李花粉萌發的培養基組合為15%蔗糖+0.004%硼酸，萌發率達41.52%。

3.3 最適貯藏方法篩選

花粉在不同的溫度下表現不同的耐貯藏力[14]。總的來說，低溫條件下花粉活力保持時間較室溫條件下花粉活力保持時間要長，本試驗也證明了這一點。花粉在干燥、低溫、真空中貯藏可以有效延長花粉活力的保持時間[15]，研究還證實超低溫條件下貯藏花粉，有效延長花粉活力保持時間[16]。對于大多數植物的花粉來說，溫度、濕度、大氣成分[17]是貯藏條件的3個重要因素，其中溫度的影響尤為重要[17]。原因是低溫降低了花粉的呼吸強度，花粉的代謝速度減小從而延長花粉活力保持時間。低溫對于延長花粉活力的保持時間是有效的。本試驗結果也表明，郁李花粉貯藏的最佳方式為超低溫（-80 ℃）貯藏，貯藏25 d后萌發率達到17.49%，室溫環境不利于花粉的長期貯藏。

參考文獻：

[1] 陳有民.園林樹木學[M].北京：中國林業出版社，2005.

[2] 左丹丹，明軍，劉春，等.植物花粉生活力檢測技術進展[J].安徽農業科學，2007，35（16）：4742-4745.

[3] 盛海強.綠色家園的彩葉植物[J].中國城市林業，2006，4（5）：53.

[4] 李志能，劉國鋒，羅春麗，等.懸鈴木花粉生活力及貯藏力的研究[J].武漢植物學研究，2006，24（1）：54-57.

[5] 邢世巖，有祥亮，李可貴，等.銀杏雄株開花生物學特性的研究[J].林業科學， 1998，34（3）： 51-58.

[6] 趙統利，周翔，朱朋波，等.百合花粉生活力測定方法的比較研究[J].江蘇農業科學，2006，6（5）：88-89.

[7] 李志軍，于軍，徐崇志，等.胡楊、灰葉胡楊花粉成分及生活力的比較研究[J].武漢植物學研究， 2002，20（6）： 453-456.

[8] Tejaswin I. Variability of pollen grain features： A plant strategy to maximize reproductive fitness in two species of Dianthus[J].Sex Plant Reprod， 2002，14： 347-353.

[9] 王雪芬，智海英，李永平，等.南瓜屬種田間雜交后代花粉活力研究[J].天津農業科學，2012，18（5）：100-102.

[10] 劉永慶.葫蘆科蔬菜花粉萌發特性的研究[J].武漢植物學研究， 1994，12（3）： 212-216.

[11] 劉會超，賈文慶.離體萌發法測定垂絲海棠花粉生活利的研究[J].山西農業科學，2007，35（5）：39-41.

[12] 崔曉龍，魏蓉城，黃瑞復.蘋果花粉生活力的研究[J].云南大學報：自然科學版，1995， 17（3）： 284-289.

[13] 加藤幸雄，志佐誠.植物生殖生理學[M].周永春，劉瑞征，譯.北京：科學出版社，1987： 176-180.

[14] 張照坤，豐震，戴慶敏，等.紫薇花粉貯藏及花粉活力的分析[J].林業科技開發，2008， 22（2）：43-44.

[15] 徐翠蓮.玉米花粉的采集、干燥和貯藏的初步研究[J].河南農業科學，1996（8）：8-9.

[16] 魏慶莒.胡楊 [M].北京：中國林業出版社，1990.

[17] 王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測定[J].植物學通報，2002，19（3）：365-373.