RNAi抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究進展

李紅梅等

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是世界上主要的豬傳染性疾病之一，以妊娠母豬發熱、厭食、早產、流產、死胎等繁殖障礙及仔豬高死亡率和育成豬呼吸困難，類流感癥狀、發育遲緩為主要的特征。該病給各個國家的養豬業帶來巨大的經濟損失，目前，疫苗和抗病毒藥物只能提供有限的保護。自2006年以來，不斷有研究者應用RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術開展抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究，并取得了一些階段性成果。對已有的研究成果進行了綜述。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；RNAi；抗病毒

中圖分類號：S852.6 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）05-0061-04

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV） 屬套式病毒目（Nidovirales） 動脈炎病毒科（Arteriviridae） 動脈炎病毒屬（Arterivirus） 成員[1]，是一種有囊膜的單鏈正股 RNA 病毒。該病毒可持續性感染豬，引起免疫抑制，目前此病已經成為危害世界養豬業安全的重要病原之一[2]。近年來，PRRSV 病毒的變異導致高致病性PRRSV的出現，給中國養豬業帶來致命的災難。然而，目前使用的 PRRSV 疫苗只能部分阻止臨床癥狀的出現，不能防治 PRRSV 感染，另外不同毒株間的交叉保護力也較低，因此人們對新型防控策略的研發充滿了期待。

RNA干擾 （RNA interference，RNAi） 是由小干擾 RNA （small interfering RNA，siRNA） 或微 RNA （microRNA，miRNA） 所引起的以序列特異性方式介導的靶 mRNA 降解或翻譯抑制的基因調控方式[3]，同時又是一種保守的抗病毒機制。近年 RNAi 技術已被用于干擾抑制多種人或畜類病毒的復制和感染研究。與傳統疫苗預防和藥物治療相比，由于 RNAi 技術能夠從源頭上有效地抑制病毒抗原基因的表達，因此 RNAi 也許是一種更有效的抗病毒策略，尤其是在動物傳染性疾病的防治方面，越來越多的證據也表明，RNAi 是生物體內一種古老而保守的抗病毒免疫形式。

對病毒而言，無論是 DNA 還是 RNA 病毒，只要其在細胞中經歷 RNA 的階段，都可能成為 RNAi 的靶標。RNAi主要抗病毒機制為：病毒在動物細胞內的復制會產生 dsRNA 復制中間體，作為激活 RNAi 的作用因子，這些中間體經加工后形成沉默復合體，特異性地與目的病毒 RNA 或 mRNA 結合，并將其降解[4]。眾多的研究已表明特異性 siRNAs 介導的 RNAi 可以抑制病毒的復制、減少病毒 RNA 的數量和阻斷病毒蛋白的表達，在病毒病的治療上顯示出一定效果[5，6]。但是病毒的進化和快速變異使其干擾 siRNA 和微 RNA（miRNA） 介導的沉默通路的能力也越來越強，在宿主細胞內病毒和宿主細胞 RNAi 的抑制作用展開了“博弈”，病毒只有能夠逃逸宿主細胞 RNAi 這種基于核酸的免疫系統方能生存[7]。

病毒逃避 RNAi 的可能分子機制：一般來說，RNA 病毒主要通過靶區域的突變或編碼病毒抑制子來逃避 RNAi 介導的抑制，或兩者兼有，而 DNA 病毒則傾向于利用病毒抑制子逃避宿主 RNAi[8，9]。理解了病毒逃避 RNAi 的分子機制，我們才能更好的設計避免病毒產生抗性的高效 RNAi 片段。

1 microRNA（miRNA） 抑制PRRSV的相關研究進展

近年來，Xiao 等[10]對人工合成的microRNAs在MARC-145細胞中抑制高致病性PRRSV的復制進行了研究，該研究團隊設計了分別靶向H-PRRSV主要結構蛋白GP5、M蛋白編碼基因的5個amiRNAs，即基于小鼠miR-155設計的由PolII啟動子驅動表達的pre-amiRNA表達載體上，使得這些amiRNAs能夠像內源性的microRNA一樣被加工成熟。結果5個amiRNAs對靶基因表達的抑制效率均在70%以上。amirGP5-370能在轉錄和翻譯水平有效抑制靶基因的表達，并能抑制H-PRRSV在MARC-145細胞中的復制。當amirM-263與其自身串聯一次后置于同一個表達框中時，串聯表達的amirM-263能有效抑制H-PRRSV感染過程中靶基因的表達和病毒復制。雙熒光素酶報告實驗表明，串聯表達amirGP5370和amirM-263能夠同時抑制GP5與M蛋白編碼基因表達。

Xia 等[11]也針對PRRSV的5' 或 3' UTR非翻譯區，人工合成6個microRNAs進行研究，結果發現有4個amicroRNAs能有效抑制PRRS病毒的復制。microRNA的研究發現進一步提高了RNAi的有效性。利用內源性microRNA的表達調控來控制PRRSV的發展是一條新的途徑。

2 RNAi 在抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒方面的研究

2.1 針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF1的RNAi的研究進展

做RNAi 實驗中，在選取目的基因時，應選取保守的、并對病毒生長繁殖影響大的基因，該基因不能與宿主基因有同源性，從而在預防和治療病毒性疾病上才能發揮作用。

在不同的毒株之間 ORF1b 比 ORF1a 更保守。所以針對 ORF1 設計的干擾靶位一般選在 ORF1b 區。通過文獻整理發現，目前共有2個研究團隊針對 PRRSV 的 ORF1b 保守區域設計了干擾片段，Li等[12-14]針對 PRRSV S1株設計的 pSUPER-P2 和 pSUPER-P3 的 shRNA 表達質粒，在 MARC-145上明顯抑制了 PRRS 病毒的復制，且 ORF1b 編碼的基因和蛋白的表達都下調幾十倍，結果證明 ORF1b 編碼的非結構蛋白質在 PRRSV 復制過程中起到了重要作用。 同時他們又將 pSUPER-P2 和 pSUPER-P3克隆到腺病毒載體上，轉染感染 PRRSV 的 MARC-145 和豬肺巨噬細胞（PAM），結果2個 shRNA 重組腺病毒組中 TCID50、靶基因 mRNA 和蛋白質水平均明顯低于 PRRSV 對照組，對病毒復制的抑制效力為100～1 000倍。ORF1b 轉錄產物的減少可以直接影響病毒在感染早期結構蛋白的表達與合成，從而影響到病毒粒子的裝配。而且 rAd-P2 可以在豬體內有效抑制 PRRSV 的復制，推遲動物發病3 d左右。證明 shRNA 重組腺病毒在體內外均能有效抑制 PRRSV 復制，為控制 PRRSV 感染提供了一種可能的新策略[14]。Bao 等[15]也針對 PRRSV-JXwn06 的 ORF1b 設計5 對干擾片段，結果篩選到2 對有效片段 pGenesil-1-1b-135 和 pGenesil-1-1b-372，這進一步證明 ORF1b 編碼基因和蛋白的功能，同時也證明了靶位點的選擇影響 RNAi 的效果。

2.2 針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組次要結構蛋白的RNAi的研究進展

GP2、GP2b、GP3和GP4 是次要的結構蛋白，針對 PRRSV 的次要結構蛋白的 RNAi 比較少，國內研究團隊主要是賀云霞等[16]針對 PRRSV CH-1a 分離株（GenBank 登錄號 AY032626）的 GP2、GP3、GP4 蛋白區構建了12個短發夾結構表達載體，轉染 MARC-145 細胞，結果篩選到5對能明顯抑制病毒復制的片段，但 ORF2、ORF3 或 ORF4 的減少并未明顯影響病毒粒子的組裝，不過減少 GP3 mRNA 能夠影響感染細胞中的病毒滴度，表明 GP3 在 PRRSV 復制或感染中有重要作用。

2.3 針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組主要結構蛋白的RNAi的研究進展

GP5、 M 和 N 是主要的結構蛋白，且它們在整個病毒復制中起重要作用，且在同一基因型毒株間相對保守。因此研究者在設計針對 PRRSV 的干擾實驗時，主要以 GP5、M 和 N 蛋白基因作為靶標。

PRRSV GP5 蛋白是由 ORF5 編碼的 PRRSV 最重要結構蛋白， 也是變異性較高的糖蛋白， 其 N 端有一個信號肽， 是 GP5 的高變異區。有關 PRRS 病毒致病機制的研究發現，克隆于哺乳動物痘病毒載體的 ORF5 表達產物可誘導細胞凋亡，表明 GP5 蛋白可能與疾病發生有關[17，18]。

Wissink等[19] 研究發現 PRRSV 病毒體的形成依賴于GP5、M 這兩個主要包膜蛋白，如缺少它們，就不能釋放出病毒粒子。研究者們針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（ PRRSV） JL/ 07/ SW 株、PRRSV -S 1株和 PRRSV-JXwn06 株 GP5 基因設計了干擾靶位，結果證實構建的部分干擾質粒可以高效抑制 PRRSV 在 MARC-145 細胞中的復制， 說明 GP5 基因是 PRRSV 復制所必需的[12，15，20 ，21]。

基質蛋白（M蛋白）由 ORF6 編碼是歐美毒株之間較為保守的蛋白[9]。黃娟[22]和 Bao 等[15]研究團隊也針對不同毒株株的 ORF6 區設計了干擾片段。最終都篩選到有效抑制 PRRSV 復制的片段。Xiao等[10]則利用慢病毒載體構建的對抗GP5和M蛋白的amiRNA能夠抑制高致病性的PRRSV在MARC-145細胞中的復制。這一發現表明豬體內可能存在一類能夠抑制PRRSV復制的microRNAs，或者PRRSV本身可能編碼microRNA。我們通過調節豬內源性microRNA的表達量或者抑制病毒本身編碼的microRNA的表達，都有可能從根本上抑制各類PRRSV毒株的復制，找到治療PRRS的治療藥物和方法。

ORF7 編碼病毒的核衣殼蛋白（N） 。在 PRRSV 感染細胞內表達水平最高，占病毒粒子總蛋白量的20%～40%，是病毒的優勢結構蛋白。 且在歐、美2種基因型中，N 蛋白高度保守[23]。且如果抑制其表達整個 PRRSV 粒子將不能夠包裝成功[24]。

黃娟[22]構建了4個靶向 PRRSV N蛋白基因的 shRNA 表達質粒，結果表明pSUPER-N3 對 PRRSV 的復制有明顯的抑制效果。將這兩種質粒共轉染 MARC-145 細胞，發現 shRNA 表達質粒對病毒復制的抑制作用具有相加性，而且用 shRNA 表達質粒轉染已經感染 PRRSV 的 Marc-145 細胞，病毒的復制也得到了抑制。研究人員還發現針對N基因的干擾片段可有效抑制病毒復制的片段，證實 N 基因可能是病毒復制所必需的結構基因[25，26，10，27-29，]。

2.4 針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組3'UTR 和5'UTR的RNAi的研究進展

黃娟[22]還通過干擾實驗證實針對 PRRSV 的 5'UTR 設計的干擾片段對病毒復制的影響并不顯著。但是，Xia等[11]則針對PRRSV- VR2332 （ATCC VR2332），PRRSV-CH-1R，PRRSV- JXA1的3'UTR 和5'UTR在體外人工合成6個amicroRNA干擾片段，結果有4個amicroRNAs有效地抑制了PRRSV病毒的復制。這與小siRNA干擾結果是不同的，但這并不矛盾。因為我們知道，shRNA編碼的siRNA需要與其綁定的靶位點序列完全匹配才能發揮作用，而microRNA與其靶序列的作用只需要8個種子堿基配對即可。同時也說明microRNA具有更強的干涉病毒復制的效果。盡管之前的研究表明針對PRRSV編碼區抑制病毒復制的效果是非常顯著的，但從遺傳學角度講，每種基因型的病毒在序列和毒力方面的變異速度是非常快的。但是同一基因型的病毒非編碼區卻是相對保守的，序列同源性也較高。如果我們能針對PRRSV不同毒株相對保守的非編碼區設計穩定表達的干擾序列，那么就有可能建立更全面的抗PRRSV不同毒株感染的戰略方法。

3 展望

RNAi 作為一項新技術，已經成為研究基因功能的新工具，研究信號傳導通路的新途徑，開展基因治療的新策略。RNAi 有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動等作用，因此可以利用 RNAi 現象產生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區段相應的 dsRNA 抵抗多種病毒。

盡管RNAi技術在抗病毒感染方面己顯示出廣闊的應用前景，但目前對RNAi機制尚不完全清楚，比如RISC的形成、組成成分、如何切割mRNA； siRNA靶位點的選擇；siRNA的穩定性以及對正常細胞有無影響；外源siRNA怎樣適時、適地、安全的導入機體靶器官并被組織細胞攝取，這些問題都有賴于RNAi的進一步發展。

目前，人工體外合成的microRNA對PRRSV的抑制作用，為針對PRRSV的RNAi研究帶來新的希望。microRNA是一個龐大的小分子調控RNA家族，廣泛存在于各種動植物中，參與細胞增殖和分化、細胞凋亡、胚胎發育、形態建成以及疾病發生等一系列重要的生命過程。相信RNAi中存在的一系列問題將不斷地得到解決。內外源性的RNAi 作為新的基因治療劑都將更加廣泛地應用于動物乃至人畜共患疾病的治療中，真正實現臨床應用， 最終成為防治動物疫病的有效手段。也許在1～2年內，我們就有可能看到基于microRNA的治療方法。

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