食品微生物之水產品中的微生物檢驗方法研究進展

[摘要] 本文以DNA和免疫學為基礎，從免疫磁珠分離法、基因芯片檢測法、傳統的PCR技術和定量的PCR技術等角度對水產品中微生物的檢測方式進行了簡單闡述。

[關鍵詞] 水產品；微生物；檢測技術

[中圖分類號] R254.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）07-0116-02

Research progress of microbial test method of aquatic product of microorganisms in food

WANG Guoqin

Pingdingshan Center for Disease Control and Prevention in Henan Province， Pingdingshan 467000， China

[Abstract] This article in DNA and immunology as the foundation， from immune magnetic bead separation， using gene chip method， the traditional PCR technology and quantitative PCR technology aspects of microorganisms in aquatic products detecting way briefly elaborated.

[Key words] Aquatic products； Microbial； Detection technology

在水產品當中存在著大量的微生物，對人類的身體健康帶來了很大的威脅，會引起腹瀉、嘔吐、敗血癥等一系列病癥。微生物對水產品的影響是造成食品安全隱患的首要因素。現在對水產品微生物檢測方向主要是對大腸桿菌、菌落總數和致病菌等研究[1]。傳統的微生物檢測方式以分離培養、血清試驗和生化技術等為主，但是，面臨的主要問題是資金使用大、人工勞動多、效率有待提高、特異性較弱等問題，沒能從根本上解決水產品的質量安全，檢測力度沒有達到標準要求[2]。隨著我國分子生物學技術的不斷發展，整體的檢測效率有了質的飛躍，主要有檢測效率高、針對性強、準確性有保證等特點，在對水產品微生物檢測方面有著很大的使用前景，并且具有很大的挖掘空間。本文對水產品中微生物的檢測方法做一探討。

1 水產品中微生物的檢驗方法

1.1 采用免疫磁珠的分離方式

之所以使用免疫磁珠的分離方式，是因為可以將特異性的抗體與磁性顆粒的表面進行關聯，可以讓樣品中的微生物進行特異性的結合，通過外部磁場的影響，裝有病毒的微生物磁性球會在其作用之下向兩端靠攏，這樣就可以使微生物從樣品當中脫離出來[3]。

這種方法較普通檢測方式而言，有著很明顯的優勢，可在含有大量細菌的溶液當中具有選擇性的將微生物分離出來，并且具有較高的效率。與使用鏡檢技術和PCR等快速檢測方式相互取長補短，免疫磁性分離技術可以將水產品微生物檢測效率大大提高。例如：在創建免疫捕獲-RT-PCR技術的過程中，即首先使用IgG抗體將甲型肝炎病毒吸收到標本之上，之后把該病毒的RNA通過逆轉錄形成cDNA[4]。使用PCR技術進行增長擴充，將傳統核酸提取方式的步驟進行精簡。這種方法體現出的優勢在于更加靈敏，可以達到逆轉錄-PCR技術與打點雜交相結合的效果。把水產品當中的李斯特菌通過免疫磁性分離進行作用，以PCR技術為基礎，可以產生具有獨特效果的李斯特菌IMS-PCR技術，對水產品進行檢測。通過使用該種技術進行檢測，我們可以得到如下結論：該方法可以保證食品基質、雜菌和培養及成分不再對PCR檢測帶來嚴重性干擾，并且具有高敏感度、高效率和高準確性的特點。

1.2 采用基因芯片檢測方式

所謂的基因芯片技術就是把每個基因寡核苷酸放在芯片的表面上，取得微生物樣本的DNA，經過PCR擴增之后可以使用熒光標記探針，與芯片表面的寡核苷酸進行點雜交，最后使用精確的掃描儀進行定量并對熒光分布進行分析，最終確定被檢測樣品當中是否存在某種微生物[5]。基因芯片檢測方式可以對微生物進行全面、高效和并行的檢測。從數據角度分析，它可以對隱藏的病原體進行檢測，使用一張芯片對某一種病原菌的各項指標進行檢測，因此具有很好的效果。例如：經過混合之后的基因組可以準確地分辨出各種李斯特菌相關聯的分離物，美國科學家經過分析，將單管復合體擴增與基因芯片技術對李斯特菌進行檢測和分辨。使用固定、高效的措施對水產品中各種微生物進行獲取、處理和分析是我們所期望的。現在，我國雖然在對樣品的處理和相關基因芯片技術有了很大程度的提高，但是，使用基因芯片方式還需要對水產品中的微生物進行深入研究，而且要對外部標準化程序、資金、設備和條件等環境進行細致化建設，亟需對這一系列問題給予解決。總而言之，基因芯片技術還有著很大的發展空間。

1.3 采用傳統的PCR技術

所謂的PCR技術，就是聚合酶鏈式反應，它是在上個世紀八十年代首先由美國科學家提出的，是一種可以在體外快速增長的特定基因，所以，又稱之為基因體外擴增技術。該技術可以在試管中進行，經過數小時的培養，可以使很少的目標基因增長數十萬倍，即把不易檢測的皮克單位擴增到易于檢測的微克單位，省去了克隆流程，縮減了大量的費時程序。現在，PCR技術已經具有對微生物病原的檢測、分析、克隆、分離以及序列分析等功能，而且在水產品微生物檢測當中也予以高度的重視。

例如：在遼寧近海地區，大量的海水樣品以及貝類中具有甲型肝炎病毒，經過分析研究，使用石英粉濾柱法將水樣品進行濃縮，同時使用PCR技術在附近海水中檢測出RNA，最終結果表明，該部分海水中存在HAV污染，在此之后，使用抗原捕捉聚合酶鏈反應技術對遼寧周邊沿海城市的水產品進行檢測，結果為RNA陽性[6]。麻痹性貝毒是由甲藻類浮游生物分泌出的，對人體神經具有一定的麻痹作用，也是水產品中毒的主要元兇之一。可以通過建立PCR快速檢測Alexandrium屬和 A.minutum污染貽貝中的相關毒素類型方式，結果得出，PCR是一種對目標浮游生物進行有效深入的檢測措施。

1.4 經過改進的PCR技術

新型的PCR技術與傳統PCR技術具有相同的原理，但是在定量技術等方面原理有所不同。經過改進的PCR技術是使用熒光染料和探針來確保增長的特異性，而且熒光信號的強與弱直接影響增長產物的多少，以此來確保準確性[7]。采取實時熒光逆轉錄-PCR方法是在常規逆轉錄-PCR檢測的基礎之上使用熒光探針，摒棄了電泳的使用，而且不再使用具有致癌作用的溴化乙錠，這樣保證了工作人員、研究人員以及環境的安全性。而且可以進行實時性檢測，與其他方法（普通逆轉錄-PCR、電鏡法）相比，更加敏感、特異，并且具有可觀的速度。例如：根據副溶血性弧菌的基因為序列設計并合成具有一定特異性的引物和熒光標記探針時，使用定量-PCR技術對蝦、魚片等水產品進行檢測，方法是在其中放入副溶血性弧菌，采用直接定量的方式檢測出的低限是102 cfu/g。通過24 h的菌類擴增培養，低限可以達到2 cfu/g[8]。

在研究的初期，使用的擴增方式是多重嵌套，在軟體動物當中取得DNA部分片段，以PCR增長之后的片段和DNA序列為基礎，分析人類糞便中的隱賈第蟲和孢子蟲的檢測結果，在貽貝的DNA中引入兩者的基因片段，以此來完成對目標檢測基因的建立，之后使用ABC-PCR檢測方式，最終表明，這種方法對貝類中隱胞子蟲和賈第蟲具有很明顯的檢測效果。

2 結語

綜上所述，對水產品中微生物進行安全性檢測是極為重要的研究課題，并且更加趨近于實時、準確。通過微生物自身的遺傳因子和免疫系統的特點來判斷微生物數量的PCR技術、免疫技術和基因技術等都有著使用范圍較廣的價值，實時處理可以更加準確地進行預防和預報。PCR技術極大地提高了檢測效果和靈敏度，但在實際操作當中還是會出現較多的假陽性現象。此外，在外部環境發生極大變化的時候，會產生相應的連鎖反應，是靈敏度等優勢下降的原因。而基因芯片技術彌補了相關不足，但是整體費用較高，所以，多種方式合理搭配，相信會找到行之有效的檢測途徑。

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（收稿日期：2012-11-30）