δ阿片受體激動劑對LPS誘導的巨噬細胞凋亡及壞死的影響

[摘要] 目的 研究δ阿片受體激動劑DADLE對LPS誘導的巨噬細胞凋亡和壞死的影響。 方法 用LPS（100 μg/L）刺激大鼠腹腔巨噬細胞，在LPS后立即或4 h后加入DADLE（10-6 M）。流式細胞儀和共聚焦成像檢測巨噬細胞凋亡及壞死，ELISA法檢測巨噬細胞細胞核NF-κB的活化水平，Western blot法檢測p38 MAPK活化水平，ELISA法檢測細胞培養上清TNF-α、IL-1β和HMGB1水平。 結果 DADLE明顯抑制了LPS誘導的巨噬細胞凋亡及壞死，降低了細胞培養上清中TNF-α、IL-1β和HMGB1的水平，而且對巨噬細胞NF-κB及p38 MAPK的活化均有抑制作用。 結論 DADLE通過抑制NF-κB及p38 MAPK的活化，減少了LPS誘導的巨噬細胞凋亡、壞死及細胞因子的釋放。

[關鍵詞] DADLE；LPS；高遷移率族蛋白1；巨噬細胞；凋亡

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）07-0009-03

Effect of delta-opioid receptor agonist on LPS induced apoptosis and necrosis of macrophages

DU Huimin1 XU Jue1 HUANG Sanxiong2 LUO Xudong1 LAN Longjiang1 Li Manqun1 BAO Ying2

1.Department of Otolarynology-Head and Neck Surgery，the First People’s Hospital Affiliated to Huzhou University Medical College，Huzhou 313000， China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，First People’s Hospital Affiliated to Huzhou University Medical College，Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To study the effect of delta-opioid receptor agonist （DADLE） on LPS induced apoptosis and necrosis of macrophages. Methods Peritoneal macrophages isolated from rats were challenged with LPS. DADLE at 10-6 M was administrated concurrently or 4h after LPS. Apoptosis and necrosis of macrophages were determined by flow cytometry analysis and confocal imaging. NF-κB activity in macrophages was determined by ELISA. Levels of activated p38 MAPK were measured by western blot. Levels of TNF-α，IL-1β and HMGB1 in culture supernatant were determined by ELISA. Results TNF-α，IL-1β and HMGB1 in supernatant were also suppressed by DADLE.LPS-induced apoptosis and necrosis of macrophages were significantly suppressed by DADLE. DADLE also inhibited the p38 MAPK and NF-κB pathways. Conclusion DADLE attenuates LPS induced apoptosis and necrosis of macrophages and cytokine release by suppressing the p38 MAPK and NF-κB pathways.

[Key words] DADLE； LPS； High-mobility group box 1 protein； Macrophage； Apoptosis

脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌的內毒素，由菌體特異側鏈、核心多糖和類脂A組成，LPS可以與Toll樣受體結合，刺激單核巨噬細胞激活、凋亡，并釋放腫瘤壞死因子（TNF）-α， 白介素（IL）-1β 和高遷移率族蛋白1（HMGB1）等細胞因子，正是這些炎癥因子介導了膿毒癥的損傷作用[1，2]。δ阿片受體廣泛表達于免疫細胞，并對免疫細胞的增殖、凋亡及信號轉導具有調節作用[3-5]。δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）是一種人工合成的非選擇性δ阿片受體激動劑，有人發現用DADLE預處理巨噬細胞后，可以下調LPS誘導的巨噬細胞p38 MAPK活化，減少TNF-α等一系列炎癥因子的釋放[4]，具有明顯的免疫調理功能。我們以往的研究發現DADLE能明顯降低膿毒癥大鼠的死亡率[6]，而其機制尚不完全明確，因此本研究通過體外實驗研究δ阿片受體激動劑DADLE對LPS誘導的巨噬細胞凋亡的影響，為DADLE對膿毒癥大鼠的保護作用尋找新的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

LPS（大腸桿菌血清型為O111：B4）和DADLE購自Sigma公司（中國上海）。TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自RD公司（美國），HMGB1 ELISA檢測試劑盒購自Shino-Test公司（日本）。

1.2 細胞培養

雄性SD大鼠（10～12周齡）腹腔注射不含小牛血清的RPMI 1640培養液10 mL，輕揉大鼠腹部2～3 min，靜置50 min后將大鼠頸椎脫臼處死，置于解剖板上，用針頭固定四肢，無菌條件下打開腹腔，用注射器抽取腹腔液，離心5 min，棄上清，應用PBS洗滌2遍，再用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI 1640培養液調節細胞濃度至1×106細胞/mL，接種于培養瓶及6孔培養板。置37℃、含5%CO2的培養箱培養2 h，棄上清液，用不含小牛血清的RPMI 1640培養液漂洗2遍然后用RPMI 1640培養基（含10%熱滅活胎牛血清、2 mM谷氨酰胺以及抗生素：青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL），在37℃、含5%CO2的恒溫箱內培養，并作臺盼藍染色、瑞氏染色。分離得到的腹腔巨噬細胞用LPS（100 μg/L）刺激，在LPS后立即或者LPS后4 h加入DADLE（10-6 M），每組設置8個復孔，并重復3次。

1.3 TNF-α、IL-1β和HMGB1的檢測

培養上清的TNF-α或IL-1β水平檢測使用ELISA試劑盒，并以純化重組TNF-α或IL-1β在不同稀釋度的標準曲線計算測定血TNF-α或IL-1β水平。培養上清的HMGB1水平檢測使用ELISA試劑盒，應用純化重組的HMGB1在不同稀釋濃度的標準曲線計算確定。

1.4 巨噬細胞核因子（NF）-κB活性測定

分離正常大鼠腹腔巨噬細胞用LPS（100 μg/L）刺激，在LPS后立即或者LPS后4 h加入DADLE（10-6 M）。LPS刺激18 h后收集細胞。用核提取試劑盒（購自Active Motif 公司）進行巨噬細胞的細胞質和核提取，按照說明書操作，基于106個細胞樣本，避免反復凍結/解凍。首先，收集細胞，置于含有磷酸酶抑制劑的預冷的PBS中。然后，將細胞懸浮于低滲緩沖液，使細胞膜變得腫脹和脆弱。添加洗滌劑，造成細胞質的蛋白質泄漏到緩沖液中。在預冷至4℃離心機14 000×g離心30 s后，收集上清以備細胞漿提取物（用以后續檢測p38 MAPK活性）。沉淀物就是細胞核，用來提取細胞核提取物。溶解細胞核，將核蛋白質裂解液溶解在含有蛋白酶抑制劑緩沖液中。核提取物制備完成后，即可檢測細胞核的NF-κB（NF-κB p65亞基）的水平，同樣，也是運用ELISA試劑盒（Trans AMTmNF-κB p65 Kit 購自Active Motif）。

1.5 巨噬細胞p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性檢測

巨噬細胞p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性檢測通過Western blot法檢測磷酸化p38 MAPK水平。使用TCA法檢測所獲得的巨噬細胞的細胞漿提取物總蛋白濃度，使用BSA作標準曲線（Pierce，IL，美國）。取等量的細胞質蛋白（100 μg）在10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF膜。將膜在室溫下放置1 h，然后放入含有5%脫脂奶粉的TBS（300 mM氯化鈉，pH值7.6的40 mM Tris）中1 h，封閉非特異性結合位點。分別與1∶1 000稀釋的抗-p38 MAPK多克隆抗體或抗磷酸化p38 MAPK的兔單克隆抗體的在含有0.1%吐溫20（TBST）的TBS（購自Cell Signaling Technology公司，上海）中4℃孵育過夜。將膜用TBST洗滌3次，然后與1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG（購自Cell Signaling Technology公司）孵育1 h。化學發光試劑增強反應，X線片壓片曝光。

1.6 流式細胞儀和共聚焦成像檢查

分離正常大鼠腹腔巨噬細胞用LPS（100 μg/L）刺激，在LPS后立即或者LPS后4 h加入DADLE（10-6 M）。 LPS刺激18 h后收集細胞。收獲的巨噬細胞懸浮在濃度為1×106個細胞/mL，用凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC（購自RD公司）測量細胞凋亡。使用FACScan（Becton Dickinson公司，加利福尼亞州圣何塞）和CellQuest軟件（Becton Dickinson公司）分析細胞死亡率。共聚焦激光掃描顯微鏡（蔡司LSM510，德國卡爾蔡司）下觀察細胞形態，并拍攝圖像。

1.7 統計學分析

采用SPSS17.0軟件處理數據。計量資料應用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DADLE抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子的釋放

在膿毒癥時炎癥因子釋放的調控是極其復雜的，除了內毒素以外，如TNF-α和IFN-γ等炎癥因子本身也可以刺激巨噬細胞/單核細胞釋放更多的炎癥因子，產生瀑布效應[7，8]。我們發現DADLE對LPS刺激后巨噬細胞炎癥因子的釋放有明顯的抑制作用（表1）。

表1 DADLE對LPS刺激后巨噬細胞炎癥因子釋放的抑制作用

（x±s，ng/mL，n = 8）

注：△與對照組比較，P < 0.05，*與LPS+生理鹽水組比較，P < 0.05，#與LPS+DADLE組比較，P > 0.05

2.2 DADLE抑制LPS誘導的巨噬細胞的細胞死亡

我們發現LPS對巨噬細胞有明顯的誘導凋亡和壞死的作用，DADLE（10-6 M）不論在LPS后立即或者4 h后給藥均能抑制LPS誘導的巨噬細胞凋亡和壞死（圖1）。

2.3 DADLE對LPS刺激后巨噬細胞的信號轉導的調控

LPS刺激后增加了NF-κΒ和p38 MAPK的激活，DADLE（10-6 M）不論在LPS后立即或者4 h后給藥均能抑制LPS誘導的巨噬細胞p38 MAPK和NF-κB信號轉導通路的激活（圖2）。

3 討論

在本研究中，我們發現DADLE明顯抑制了LPS誘導的TNF-α和IL-1β及HMGB1的產生，雖然早期炎癥因子TNF-α和IL-1β可能并不是膿毒癥的關鍵介質[9]。而HM-GB1作為晚期炎性因子，是膿毒癥致死效應的重要炎性介質。給予HMGB1可模擬嚴重膿毒癥的病理生理，引起發熱、腸屏障功能的紊亂、急性肺損傷和多器官功能衰竭[9-11]。運用HMGB1的特異性拮抗劑中和血清HMGB1能改善內毒素血癥和膿毒癥[12，13]。因HMGB1有較寬的治療時間窗，已被確定作為治療的靶點。我們的研究結果表明，DADLE對LPS誘導的抑HMGB1的釋放，可能是膿毒癥治療過程中減輕炎癥反應的關鍵所在。

巨噬細胞活化是膿毒癥的炎癥損傷的一個關鍵組成部分，活化過程中產生活性氧（ROS）和各種炎性細胞因子[14]。p38 MAPK和NF-κΒ途徑對巨噬細胞活化和細胞因子的釋放[15-18]起到關鍵作用。我們的研究發現δ阿片受體激動劑調節巨噬細胞活化，并通過調節LPS誘導的p38 MAPK和NF-κB的活化來抑制炎癥因子的釋放。膿毒癥過程中巨噬細胞的凋亡和壞死同樣扮演了重要作用，以前的研究表明，只有壞死的細胞才可以釋放HMGB1到細胞外環境，引起炎癥反應，而細胞凋亡則不會[19]。但有研究表明，當細胞凋亡轉變到晚期凋亡[20，21]時可釋放HMGB1并引起炎癥反應。因此，細胞死亡，無論是凋亡或壞死，均能引發膿毒癥的炎癥級聯反應，最終導致休克。我們的研究結果顯示，DADLE能夠減少LPS誘導的巨噬細胞的死亡，下調HMGB1的釋放。

因此可以推測，DADLE對膿毒癥大鼠的保護作用的機制可能是降低p38 MAPK和NF-κΒ的活性，抑制巨噬細胞的活化和凋亡，從而減少HMGB1的釋放。

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（收稿日期：2012-12-28）