機械力化學方法對大豆分離蛋白提取的影響

邱 嵐 高健強

QIU Lan GAO Jian-qiang

（銅仁學院生物科學與化學系梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州 銅仁 554300）

(Guizhou Tongren College,The Key Laboratory of Characteristic Animal and Plant Resources of Fanjing Mountain,Tongren,Guizhou 554300,China)

大豆蛋白質是空間結構緊密、二硫鍵構架牢固的蛋白，酶分子難以打開其表面結構，不能進入蛋白分子內部，使得水解反應難以進行，從而導致大豆酶解產肽率相對較低[1]。對大豆蛋白功能性質進行改善是大豆蛋白分離(SPI)研究的熱點，目前大豆分離蛋白分離技術有生物技術、物理技術、化學技術和復合技術[2]。機械力化學反應作為一種機械處理的物理化學方法，是近年來的一個新技術。機械力化學也是化學領域的一個分支,它是粉碎技術不斷深入發展的產物[3]。近年來,機械力化學技術被廣泛應用于無機非金屬材料和金屬材料加工領域[4]。機械力化學反應是固體物質在各種形式的機械能作用下所激發的化學變化和物理化學變化，以此來制備新材料或對材料進行改性處理[5，6]。物料經機械化學應力的作用，可對某些天然生物資源的理化性能、功能特性和食用特性產生多方面的影響[7]。研究機械化學反應力作用對提高大豆分離蛋白產率具用實際意義。

前人[8～10]在軟飲料加工和中草藥制備改性應用中研究機械化學反應力的應用的比較多。目前，利用機械化學反應力技術已經開發出的軟飲料和中草藥有：豆類固體飲料[11]、粉茶[12]、魔芋保健粉[13]、復方貝母散[14]等。經過機械化學反應加工制備后的物料，具有小粒徑、大比表面積，在物理、化學等反應過程中，大大增加了反應接觸的面積，進而提高了有效的成分提取和浸提過程的化學反應速率，生產過程既節約時間又提高效率[15～17]。因此，通過機械化學應力作用改變大豆分離蛋白的物理化學性質，在大豆分離蛋白降解中應用，具有一定的應用價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高溫脫脂大豆粕：蛋白質47.346%，水分9.464%，脂肪0.429%，灰分3.957%，市售；

HCl:分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

NaOH:分析純，華東醫藥試劑有限公司；

純水、蒸餾水：實驗室Millipore純水機自制。

1.2 儀器與設備

扁平式超音速氣流粉碎系統：QLFS-100型，常州市益球中亞干燥設備廠；

粉碎機:RT-300型,榮聰精密科技有限公司;

微粉機:BFM-T6BI型,濟南貝利粉碎技術工程有限公司;

恒溫磁力攪拌器:79-1型,江蘇國勝電器有限公司;

分析天平：HR-200型，上海方瑞儀器有限公司；

離心機：CR-21G型，日立工機株式會社；

恒溫水浴鍋：HH.S21-4型，上海百典儀器設備有限公司；

pH計：PHS-3E型，上海雷磁有限公司；

分光光度計：U-2010型，日立工機株式會社；

測量顯微鏡：107JPC型，上海光學儀器廠；

凱氏定氮儀：2100型，瑞典FOSS公司；

恒溫水浴振蕩器：SHAB型，金壇市國旺實驗儀器廠；

激光粒度分析儀：BT-9300H型，丹東百特科技有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-6301F型，日本JEOL公司。

1.3 試驗方法

機械力化學方法制備大豆粉體的方法：取高溫大豆粕,在50～60℃下干燥，進行不同粉碎程度的處理，得到以下3種不同粒度的荷葉樣品,備用。試驗分為3個處理，每處理3個重復。

(1)樣品1：干燥的粗樣品經取一定量高溫大豆粕用RT靜音粉碎機粉碎,過180μm篩,得到的粉體稱為粗粉；

(2)樣品2：對樣品1在QLM扁平式超音速氣流粉碎系統粉碎至中位徑D50=30μm；

(3)樣品3：對樣品1在BFM-T6BI“貝利”微粉機粉碎至中位徑D50=10μm。

大豆分離蛋白采取堿溶酸沉法工藝[18,19]：

高溫脫脂豆粕→清理→一次堿溶→二次堿溶→固液分離→酸沉→離心分離→酸堿調節→濃縮→濃縮干燥

具體提取方法步驟[20]：第一次堿溶料液比1∶12(m∶V)，浸提液濃度1mol/LNaOH，調pH值至9.0，攪拌15min，靜置30min；第二次堿溶料液比1∶8(m∶V)，浸提液濃度1mol/L NaOH，調 pH值至 9.0，攪拌 15min，靜置 30min；酸沉，浸提液濃度1mol/LHCl，調pH值4.5，停止攪拌，靜置30min。

1.4 測定方法

1.4.1 粉體特性 取樣品適量，加一定量無水乙醇分散，用滴管移取少量于裝有無水乙醇比色皿中，置BT-9300H型激光粒度分布儀測定粒徑分布及比表面積；JCM-6000 Neo－Scope臺式掃描電子顯微鏡用于大豆蛋白粉顆粒表面形貌表征，分別取3種粉體各少許鋪于掃描電鏡樣品臺上，噴金鍍膜后觀察不同粒徑分布紅花粉體的結構及表面形態。

1.4.2 化學分析

(1)高溫大豆粕蛋白成分測定分別按照GB/T 5009.6——2003、GB/T 5009.3——2010、GB/T 5009.5——2010、GB/T 5009.4——2010的方法分別測定其蛋白質、脂肪、水分和灰分的含量。

(2)分離蛋白測定：按照GB/T 5009.6——2003測定最終提取液中的蛋白含量。按式(1)計算分離蛋白（SPI）提取率。

1.4.3 數據分析 數據計算與處理、相關分析用Origin 8.0與Microsoft Office Excel 2003軟件進行；方差分析和多重比較采用SPSS 13.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 大豆蛋白粉粒度分析

粒度或粒徑表示顆粒的大小，通常是以單個顆粒為對象，而一堆粉體所涉及的并非單個顆粒，包含不同粒徑的若干顆粒的集合體，即顆粒群。粒度分布就是以顆粒群為對象，表示該粒群中所有顆粒在一定粒度范圍內的分布特征，它反映了各種顆粒大小及對應的數量關系[21]。粒度分布范圍的不同造成顆粒群的物理化學性質也不同。用BT-9300H激光粒度分析儀測定3個樣品的粒度分布，得出3個樣品粉體粒度分布曲線見圖1～3。

圖1 樣品1激光粒度分布Figure 1 Particle size distribution of Sample 1

圖2 樣品2激光粒度分布Figure 2 Particle size distribution of Sample 2

測定粉體的粒徑，樣品1的D90為274.54μm，D50為158.00μm；經過機械力化學處理的樣品2的D90為26.79μm，D50為10.03μm；樣品3的D90為10.45μm，D50為3.97μm。3種粉體的分布結果見圖1～3。通過激光粒度分布儀分析可知，隨著機械力化學作用方式的改變，大豆分離蛋白的中位徑、體積平均徑、面積平均徑逐漸減小，比表面積逐漸增大。出現上述原因主要是因為氣流破碎原理主要是依靠高速氣流使料粉與料粉、料粉與內壁之間的產生強碰撞而達到破碎的效果；而震動粉碎的原理是物料由加料斗進入粉碎室，經振動將粉碎室內的研磨棒與物料碰撞、研磨而獲得粉碎，該機配有水冷裝置，可控制粉碎室內的溫度。由于大豆蛋白屬于有機態，富含脂肪，同樣研磨時間，氣流粉碎的效果相對振動粉碎效果偏弱一些。

圖3 樣品3激光粒度分布Figure 3 Particle size distribution of Sample 3

2.2 大豆蛋白粉的顆粒性貌分析

顆粒表面形貌對顆粒群的物理和化學性質產生諸多影響，如顆粒的比表面積、分散性、化學活性等[22]。取3種粉體少許，用適當溶媒分散，滴取樣后自然干燥，黏臺噴金，利用電子顯微鏡對4個樣品進行表面形貌觀察，用臺式掃描電子顯微鏡對3種大豆蛋白粉顆粒表面形貌表征如圖4～6。

圖4 樣品1掃描電鏡照片（1 000倍）Figure 4 SEM micrographs of Sample 1

圖5 樣品2掃描電鏡照片（1 000倍）Figure 5 SEM micrographs of Sample 2

圖6 樣品3掃描電鏡照片（1 000倍）Figure 6 SEM micrographs of Sample 3

由圖4可知，樣品1粉體顆粒粒徑普遍偏大，顆粒大小形狀分布不均勻，表面無裂痕，結構緊密，有明顯的斷口塊狀結構；由圖5可知，樣品2與樣品1相比，隨著顆粒粒徑減少結構更加緊密；由圖6可知，樣品3顆粒粒徑偏小，顆粒表面較粗糙,且顆粒大小形狀分布均勻，結構普遍松散，呈碎屑狀，無明顯的斷口。隨著顆粒粒徑減小，比表面積增大，表面破損程度越嚴重，內部結構的有效成分越容易析出。與樣品1相比，樣品2和樣品3經機械力化學處理后，粒徑分布更加均勻，粉體粒徑更小，比表面積也就越大。其特有的特征，如纖維性、晶型等均會失去。由圖5可知，過180μm篩的大豆蛋白粉在放大1 000倍的電鏡下仍可觀察到較完整的植物組織結構，大部分細胞未被破碎。而經機械化學處理后，在放大1 000倍的電鏡下已觀察不到完整細胞，樣品2的D90為26.79μm，樣品3的D90為10.45μm，豆粕細胞可能已被充分破碎，細胞內的成分被暴露出來，呈釋放狀態。由此可知，顆粒粒徑減小，比表面積增大，在機械力化學作用下造成細胞破碎而有利于大豆分離蛋白的溶出。

2.3 機械化學反應力對大豆蛋白分離的影響

機械力化學處理的機械力作用將會導致不同粒徑顆粒化學成分的不同[23]。不同粒徑當大豆蛋白粉的粗蛋白含量與蛋白質的溶解率詳見表1。由表1可知，樣品2和樣品3大豆蛋白粉中的蛋白質浸出率分別比樣品1提高47.6%、82%，與樣品1大豆蛋白粉體中蛋白質的浸出率相比差異顯著。大豆蛋白粉體粒度越小，蛋白質的溶解率越高。特別是當粒徑D50為30μm時，其溶解率顯著提高，而顆粒粒徑D50為10μm時，蛋白質的溶解率最高為65.91%。由表1還可以得出，樣品2及樣品3豆粕組大豆分離蛋白的提取率兩者差異極顯著，樣品2及樣品3豆粕組分離蛋白中蛋白的含量無顯著差異。可見，不同的粒徑分布可顯著提高大豆分離蛋白的提取率，但是對其粗蛋白含量提高無差異。

表1 機械化學處理對SPI提取率及蛋白含量的影響覮Table1 Effectof SPIand protein contentof Mechanical-chemical /%

4 結論與討論

一方面由于機械力化學作用，經機械力化學處理后的豆粕，顆粒粒徑減小，比表面積增大，豆粕細胞可能已被充分破碎，細胞內的成分被暴露出來，呈釋放狀態。由此可知，在機械力化學作用下造成細胞破碎而有利于大豆分離蛋白的溶出。另一方面樣品2及樣品3豆粕組大豆分離蛋白的提取率分別為53.46%和65.91%，兩者差異極顯著，樣品2及樣品3豆粕組分離蛋白中蛋白的含量分別為78.79%和79.78%。可見，不同的粒徑分布可顯著提高大豆分離蛋白的提取率，但是對其粗蛋白含量提高無差異。

目前，機械力化學處理可選擇的設備普遍很多，常見的機械力化學處理設備有振動磨、氣流粉碎系統、球磨機、攪拌磨、沖擊式粉碎機等多種類型[24]。試驗對QLM扁平式超音速氣流粉碎系統與BFM-T6BI貝利振動粉碎機進行了比較分析試驗，結果表明，以BFM-T6BI貝利振動粉碎機效果最好，相同粉碎時間，粉體粒徑普遍較小，細胞破壞嚴重，可控制溫度，有效成分的溶出率高。

1893年Lea最早進行機械力化學試驗[4]。1951年Peters和Cremer對機械力化學進行系統的研究，Peters發表《機械力化學反應》的論文,指出能觀察到研磨過程中各種固態反應，從而機械力化學引起了全世界廣泛的關注[25]。機械化學反應作為一種機械處理的物理化學方法，是近年來的一個新技術。是化學領域的一個分支,也是粉碎技術不斷深入發展的邊緣學科。近年來,機械力化學技術被廣泛應用于無機非金屬材料和金屬材料加工領域。機械力化學反應是固體物質在各種形式的機械能作用下所激發的化學變化和物理化學變化,以此來制備新材料或對材料進行改性處理。物料經機械化學應力的作用，可對某些天然生物資源的理化性能、功能特性和食用特性產生多方面的影響。食品經機械力化學處理，可使粉體粒徑減小，具有極大的比表面積，粗糙程度增加，細胞破壁率提高，在生物、化學等反應過程中，反應接觸的面積大大增加了，從而提高了有效成分的溶出率，且對有效成分改性，易于有效成分在人體吸收利用[26]。但機械力化學處理技術在食品加工領域中的應用也屬于起步階段，仍存在一些亟待解決的問題。食品經過機械化學反應力處理后的原料，可以提高發酵、酶解過程的化學反應速度，生產中節約了時間，提高了效率。因此，通過機械化學應力作用改變大豆分離蛋白的物理化學性質，在大豆分離蛋白降解中應用，具有一定的應用價值。

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