半枝蓮多糖提取工藝優化

黃秀香 覃 玥 黃艷梅

HUANG Xiu-xiangQIN YueHUANG Yan-mei

（河池學院化學與生命科學系，廣西 河池 546300）

(Departmentof Chemistry and Life Science,Hechi University,Hechi,Guangxi546300,China)

半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)為唇形科黃芩屬植物，主產于江蘇、浙江、福建、廣西和廣東等地，全草入藥。具有解熱、抗癌、免疫調節等藥理作用[1]。半枝蓮中的化學成分主要含有生物堿、糖類及黃酮類化合物[2]。多糖是半枝蓮中一種重要的活性成分，對半枝蓮多糖的提取工藝研究并不多見，而采用超聲波協同復合酶法提取半枝蓮多糖更是少見。由于超聲波有獨特的機械效應、熱學效應及空化效應，以及其粉碎和攪拌的特殊作用[3]；復合酶對降解細胞壁，不僅有利于多糖的溶出，還可以降低溶液的黏度，從而提高多糖得率，所以本試驗利用超聲波協同復合酶法提取半枝蓮多糖。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半枝蓮干品：購自廣西宜州市；

葡萄糖標準品：汕頭市西隴化工廠；

鋁片、無水乙醇、95%乙醇、苯酚、碳酸氫鈉、濃硫酸、石油醚(60～90℃)、活性炭、檸檬酸、磷酸氫二鈉：分析純，汕頭市西隴化工廠；

纖維素酶：活性≥1 800 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；

果膠酶：活性≥1 000 U/mg，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

微型植物粉碎機：FZ102型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV－2501型，日本島津公司；

精密pH計：PHS-25型，上海精密科學儀器有限公司；

電子天平：AL204型，奧豪斯儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 半枝蓮多糖提取工藝

(1)材料預處理：稱取試樣半枝蓮粉末，按照料液質量體積比為1∶3的比例加入石油醚(60～90℃)浸漬4～5 h，脫脂處理，然后進行減壓抽濾，收集濾渣，置烘箱中，在50℃的條件下烘干，12 h后取出，放入干燥器內備用。

(2)提取工藝流程：

稱取半枝蓮粉末（10 g）→加100mL蒸餾水→調節pH 4.5→加復合酶（纖維素酶與果膠酶質量比為1∶1）0.020 g→50℃酶解30 min→超聲波作用20 min→沸水浴滅酶→抽濾→脫色→抽濾→95%乙醇沉淀→靜置過夜→洗滌→烘干→得粗多糖→20 mL蒸餾水溶解（50℃）→濃縮（去雜）→乙醇沉淀→無水乙醇洗滌→得精多糖

1.3.2 標準葡萄糖溶液的配制 精密稱取在105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，加蒸餾水溶解，轉移到100mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用。

1.3.3 苯酚—硫酸法葡萄糖標準曲線的制作 根據文獻[4]，得回歸方程：A=12.121C+0.008 1(r=0.999 6)，線性范圍0.005～0.015mg/mL，符合線性關系。

1.3.4 換算因子的測定 精密稱取半枝蓮多糖121 mg于100 mL容量瓶中，加少量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取配置好的多糖溶液 4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL 于50mL容量瓶中，定容后從中分別吸取2 mL于比色管中，再加入1 mL新配置的5%苯酚和5 mL濃硫酸，振蕩，靜置30min后測量其吸光度[5]。按式(1)計算換算因子：

式中：

f——換鼻因子；

W——稱取多糖的質量，mg；

C——多糖中葡萄糖的質量濃度，mg/mL；

D——半枝蓮多糖的稀釋倍數。

經過式(1)求得換算因子為2.70。

1.3.5 多糖得率的計算方法 多糖得率按式(2)計算：

式中：

R——多糖得率，%；

C——半枝蓮多糖溶液中葡萄糖的質量濃度，mg/mL；

D——多糖溶液的稀釋倍數；

f——換算因子；

W——半枝蓮樣品的質量，mg。

1.3.6 半枝蓮多糖提取單因素條件的研究

(1)pH對多糖得率的影響：準確稱取2.000 0 g半枝蓮粉末，蒸餾水做提取劑，料液比1∶40(m∶V)，并搖勻，分別調節pH 為 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，加入酶量 0.015 g（纖維素酶與果膠酶質量比為1∶1），在50℃水浴下酶解30 min，超聲20min后，沸水浴滅酶10 min，抽濾，用活性炭脫色，減壓抽濾，收集濾液，將濾液轉移到容量瓶中，加入蒸餾水定容，按方法1.3.3測其吸光度，計算多糖得率。

(2)復合酶量對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉 末 2.000 0 g，pH 4.5， 酶 量 0.010，0.015，0.020，0.025，0.030 g（纖維素酶與果膠酶質量比為1∶1），按方法1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

(3)料液比對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉末2.000 0 g，pH 4.5，酶量0.020 g（纖維素酶與果膠酶質量比為 1∶1），料液比 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60(m∶V)，按方法1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

(4)超聲時間對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉末2.000 0 g，pH 4.5，酶量0.020 g（纖維素酶與果膠酶質量比為 1∶1），料液比 1∶20(m∶V)，超聲時間10，15，20，25，30，35min，按方法1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

(5)酶解溫度對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉末2.000 0 g，pH 4.5，酶量0.020 g（纖維素酶與果膠酶質量比為 1∶1），料液比 1∶40(m∶V)，超聲時間 20min，酶解溫度30，40，50，60，70 ℃，按方法 1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

2 結果與分析

2.1 單因素提取半枝蓮多糖的結果

2.1.1 pH對多糖得率的影響 由圖1可知，pH在4.0～5.0條件下，酶活性逐漸升高，與底物作用的速度加快，當pH值達到5.0時，多糖的得率達到最大值；隨著pH值繼續增大，多糖的得率開始下降。這可能是因為pH值過高或過低都會影響酶的活性，從而造成多糖得率的下降。

圖1 pH對多糖得率的影響Figure 1 Effectof pH on the extraction yield

2.1.2 復合酶量對多糖得率的影響 由圖2可知，隨著復合酶量的增加，復合酶與底物接觸機會增加，多糖得率隨之升高；復合酶量大于0.020 g時，得率開始下降。這可能是由于當酶含量升高到一定程度，酶分子過于飽和，一部分沒有機會與底物結合，酶解速度降低[6]，得率下降。

2.1.3 料液比對多糖得率的影響 由圖3可知，料液比為1∶20～1∶40(m∶V)時，多糖得率隨溶劑量比例的增大而升高，之后繼續增大料液比，酶濃度降低，酶與底物的結合不充分，多糖得率下降。

2.1.4 超聲時間對多糖得率的影響 由圖4可知，半枝蓮多糖的得率隨超聲時間的增加，有所提高，20min后，多糖得率呈現下降。因為長時間超聲會使多糖分子在超聲波的剪切作用下發生破壞或降解。

圖2 復合酶用量對多糖得率的影響Figure 2 Effectof compound enzyme dosage on the extraction yield

圖3 料液比對多糖得率的影響Figure 3 Effect of ratio of scutellaria barbata D.Don to ethanol on the extraction yield

圖4 超聲時間對多糖得率的影響Figure 4 Effectof ultrasonic time on the extraction yield

圖5 酶解溫度對多糖得率的影響Figure 5 Effectof enzymolysis temperrature on the extraction yield

2.1.5 酶解溫度對多糖得率的影響 由圖5可知，多糖得率隨著酶解溫度的增高而逐漸增大，50℃時，多糖得率達最大，而后，隨酶解溫度增高呈現下降。這是由于酶的活性與溫度有著密切的關系，每一種酶都有特定的最適溫度。若溫度繼續升高，酶在高溫下出現變性，酶活力逐漸下降，反應速度降低，多糖得率下降[6]。

2.2 正交試驗設計

影響超聲波協同復合酶提取的主要因素為pH、復合酶量、料液比、超聲波時間、酶解溫度，以多糖得率為考察指標，由單因素試驗初步篩選出5個單因素的取值范圍（見表1），利用L16(45)正交正交試驗，確定最佳提取工藝。

由表2、3可知，各因素對半枝蓮多糖得率的影響程度強弱為料液比>超聲時間>復合酶量>pH>酶解溫度。通過極差分析可知最優工藝組合為A2B4C4D1E3，即pH 4.5，復合酶量0.025 g，料液比 1∶60(m∶V)，超聲時間 15 min，酶解溫度50℃，其中料液比對試驗的影響顯著。

2.3 最佳工藝的驗證實驗

表1 正交試驗因素水平表Table1 Orthogonal factor level table

表2 正交設計結果Table2 The resultof orthogonal design

按該工藝的最佳提取條件A2B4C4D1E3，進行5次驗證實驗，測得多糖的平均得率2.166%，優于正交試驗中的任何一組，RSD為0.005%，說明提取工藝可行。

2.4 穩定性試驗

取樣品溶液2.0mL，按1.3.3中標準曲線法的操作方法于室溫條件下每隔20min測定1次吸光度值，重復做6次，結果發現此樣品溶液放置100min內基本穩定，相對標準偏差RSD=0.014%，結果見表4。

表3 方差分析結果Table3 Analysis of variance orthogonal design

表3 方差分析結果Table3 Analysis of variance orthogonal design

F0.10(3,3)=9.28，F0.01(3,3)=29.46。

偏差來源 自由度F值ABCDE離差平方和0.014 0.020 0.736 0.034 0.007 33333均方0.005 0.007 0.246 0.011 0.002 2.500 3.500 123.0 5.500顯著性不顯著不顯著顯著不顯著

表4 穩定性試驗結果Table4 Results of test stability

2.5 加樣回收率試驗

精密移取已知含量的半枝蓮粗多糖樣品溶液1 mL 6份，別置于6個25mL容量瓶中，分別加入葡萄糖標準溶液1mL，按方法1.3.3測定其吸光度，計算回收率。由表5可知，在A2B4C4D1E3條件下，樣品加樣平均回收率為90.918%，RSD為2.168%，說明此方法具有較好的加樣回收率。

3 結論

本試驗采用超聲波協同復合酶法提取，用正交試驗的方法對半枝蓮水溶性多糖的提取工藝進行了優化研究，采用苯酚—硫酸法測定半枝蓮多糖的得率，結果表明，料液比對多糖得率的影響最大，其次是超聲時間，然后是復合酶量，再次是pH，酶解溫度影響最小。其最優工藝組合為pH 4.5，復合酶量0.025 g，料液比為1∶60(m∶V)，超聲時間15min，酶解溫度50℃，該條件下多糖得率為2.166%，而且該提取工藝穩定性、重復性良好。

表5 加樣回收率試驗結果Table5 Results of test recover

超聲波協同復合酶提取半枝蓮多糖，超聲波能產生較大剪切力，再加上復合酶的酶解作用，從而使得半枝蓮細胞壁破裂，加速活性成分多糖的溶出，從而提高得率。該法具有條件溫和、節能、省時、操作簡單等優點[7]，具有一定的推廣意義。

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