酸乳體系中乳酸菌胞外多糖與蛋白相互作用研究進展

曾令鶴 錢 方 姜淑娟 牟光慶

ZENG Lin-he QIAN Fang JIANG Shu-juanMU Guang-qing

（大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034）

(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China)

酸乳制品在生產過程中易出現組織結構松散、凝膠性差、乳清析出等問題已成為近年研究重點。酸乳的組織結構主要是蛋白在酸性條件下發生凝集形成空間網狀結構所致。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）作為乳酸菌生長代謝過程中自身不斷產生并分泌到細胞壁外的糖類化合物[1]，主要通過與蛋白發生作用，影響蛋白網狀結構的構建，從而在較低濃度下對酸乳的黏度、粘彈性、持水力、質構、風味等產生顯著影響[2]，改善酸乳品質[3]。

1 多糖與蛋白相互作用研究

多糖和蛋白之間發生的相互作用主要有非共價作用和共價作用兩種[5]。非共價作用主要有強的靜電作用和弱的相互作用（氫鍵、范德華力、疏水相互作用等）。強的靜電作用主要由帶電多糖與蛋白形成；中性多糖和蛋白之間不發生相互作用或者發生弱的相互作用[6]。共價作用主要通過Maillard反應產生[7，8]。兩者的相互作用會改善蛋白質的溶解性、熱穩定性、起泡性以及乳化性等[9]。

目前對多糖和蛋白的作用研究主要集中在兩元體系，研究發現多糖會通過吸附多個蛋白使得蛋白間發生聚合甚至沉淀。Jiulin X等[10]利用電泳光散射和準彈性光散射法發現在稀溶液中蛋白和多糖最初的相互作用發生在分子水平，且多個蛋白與單個多糖鏈相連。隨著pH降低，這些大分子進一步聚合，絮凝。Doublier等[11]也發現多糖分子通過吸附多個蛋白膠粒連成橋或者聚合與蛋白發生相互作用。單個多糖分子會吸附至多個蛋白質表面，將蛋白膠粒橋連起來。

體系環境（pH、溫度、離子強度等）、多糖的添加量以及兩種物質的結構（分子大小、帶電量以及電荷分布情況等）都會影響蛋白和多糖之間的作用。Maude等[12]采用電勢滴定法和離心法研究了幾種陰離子胞外多糖和蛋白的相互作用，發現帶電荷的胞外多糖主要通過離子作用和蛋白反應，限制蛋白的聚合沉淀，且所帶電荷越多，與蛋白的作用越強。

2 酸乳體系中乳酸菌胞外多糖和蛋白相互作用研究

胞外多糖作為多糖的一種，可通過乳酸菌發酵直接產生，無需人為添加，因而在酸奶中作為良好的穩定劑及增稠劑應用廣泛。胞外多糖在酸乳中的含量較低(50～2 700mg/L)，對酸乳質構的影響主要是通過與乳中蛋白發生相互作用所致。要研究酸乳體系中兩者的相互作用，首先要了解牛奶蛋白穩定體系的構成，酸奶發酵過程中蛋白的失穩，進而研究胞外多糖產生后與蛋白作用對蛋白簇乃至酸乳結構的影響。

2.1 牛乳中蛋白的穩定體系

牛乳中的蛋白主要有酪蛋白、乳清蛋白兩種。其中酪蛋白的比重較大，約占總蛋白的80%，由α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。作為牛乳中的主要成分，酪蛋白的穩定決定了牛乳的穩定。在牛乳中，酪蛋白以穩定的膠粒形式存在[13]。目前普遍認為酪蛋白膠粒是由亞膠束通過內部氫鍵及疏水相互作用與少量的膠態磷酸鈣相連而成，如圖1所示。亞膠束分為兩種：一種疏水性較強，主要由α-酪蛋白及β-酪蛋白構成，一般在形成的膠粒內部；另一種親水性較強，主要由α-酪蛋白及κ-酪蛋白構成，一般在形成的膠粒外部[14]。

圖1 酪蛋白亞膠束模型Figure 1 Caseinmicellemodel

酪蛋白膠粒之所以能以穩定的形式存在于牛乳中，是因為膠粒之間發生了空間位壘以及靜電排斥兩種作用。酪蛋白的等電點大概在4.6左右，在牛乳（pH 6.5～6.7）中帶負電，膠粒間發生靜電排斥作用，一定程度上保證了酪蛋白的穩定。膠粒表面是κ-酪蛋白，其碳端發生親水作用，在膠粒表面形成高密度的水化層，即κ-酪蛋白的“毛發層”，當膠粒互相之間發生碰撞時，毛發層因為疏水相互作用互相排斥，產生空間位壘效應，防止膠粒之間接近，造成膠粒無法凝集，最終乳體系保持穩定[15]。

牛乳中乳清蛋白含量較小，約占總蛋白量的20%，主要由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等構成[16]。乳清蛋白主要以乳清蛋白聚合物及乳清蛋白—酪蛋白聚合物的形式穩定存在于牛乳中[17]。

體系中pH、溫度、鹽離子濃度等都會對蛋白在牛乳中的穩定存在產生較大的影響[18]。牛乳進行加熱處理(不超過100℃）時，不影響酪蛋白的化學性質，但維持其膠粒的次級鍵發生改變，疏水鍵暴露，對牛乳的穩定體系產生一定影響。乳清蛋白因含有大量的二硫鍵和巰基故對熱比較敏感，加熱過程中β-乳球蛋白的三級結構會解體，多肽鏈打開，疏水基團暴露，分子間二硫鍵發生互換，形成聚集體。繼續加熱，α-乳白蛋白發生變性，與β-乳球蛋白聚集體繼續締合，形成更大凝集體。隨著加熱的進行，變性的乳清蛋白進一步和酪蛋白膠粒表面的κ-酪蛋白締合，形成酪蛋白膠粒—變性乳清蛋白復合物。

2.2 酸乳中蛋白的失穩

酸乳的發酵過程中，pH從6.7降至5.8左右時，膠粒容積度降低，失去礦物質，大部分膠態磷酸鈣溶解[15]，pH繼續下降，達到酪蛋白的等電點時，膠粒表面的κ-酪蛋白坍塌，電解質層裂解，膠粒縮小，ξ-電位降低[19]。膠粒表面電荷由負電變為正電，靜電排斥作用減弱，同時膠粒的縮小使得空間位阻減弱，蛋白發生聚集沉淀[20]。

2.3 酸乳體系中兩者作用時間及方式研究

酸乳體系中，胞外多糖和蛋白發生非共價作用，主要通過靜電作用或空間位壘作用影響酸乳的質構[21]。靜電作用主要由帶電胞外多糖和蛋白產生，兩者的相互作用會改變酸奶中鈣離子平衡，阻止膠粒表面κ-酪蛋白的坍塌，促使網狀結構重組。空間位壘主要由中性胞外多糖自身產生，它會影響酪蛋白簇、酪蛋白—乳清蛋白聚合體的動態變化，打破蛋白凝膠體系中處于連續相的蛋白質膠粒，進而改變酸乳的凝膠結構[22]。關于酸乳中哪種作用占主導，目前尚無定論，一般認為空間位壘起主要作用。

關于兩者發生作用的時間，早先有學者[23，24]發現胞外多糖產生后即開始與蛋白發生作用，發生熱力學不相容現象，混合體系穩定性降低。但新近研究[25]表明，胞外多糖的存在對發酵過程中的酪蛋白膠粒聚合前和聚合中都無影響，在之后的凝膠化過程中才開始起作用。Eleana等[25]利用擴散波光譜技術研究發酵早期蛋白的凝集以及空間網狀結構的形成，結合流變學和微觀結構觀察研究從蛋白開始失穩到形成網狀結構過程的動力學。研究發現胞外多糖存在與否對酸乳中酪蛋白膠粒的擴散系數和表觀半徑(5.21±0.07，5.23±0.11)無明顯影響，說明L.lactis subsp.Cremoris JFR1產生的胞外多糖對酪蛋白膠粒聚合早期無明顯作用。發酵后期，通過比較儲能模量(G'值)，pH 4.6時tanδ值(介損)說明胞外多糖在凝膠化中后期開始起作用。可能是因為乳酸菌胞外多糖一般在菌株對數生長的末期和穩定期產生[26]，此時蛋白之間已經發生聚合，故胞外多糖對酪蛋白膠粒的早期聚合不能起作用。

關于兩者作用后的結合方式，學者普遍認為多糖是鑲嵌在蛋白簇中心或網狀結構的空隙部分，形成富含多糖的區域[27]。Hassan等[24]用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察酸乳凝膠的顯微結構，發現酸乳的凝膠網狀結構中大的空隙被菌體填充，菌體周圍是多糖圍繞。Ayala-Hernandez等[28]利用掃描電子顯微鏡發現酸乳體系中胞外多糖并不是簡單地覆蓋在蛋白簇的表面或者空隙部分，而是呈鏈狀將蛋白簇和菌體連接起來。這可能是因為胞外多糖產生在蛋白膠粒聚合之后，被限制在網狀結構的空隙內。這種空間限制阻礙了胞外多糖和蛋白之間的作用。此時蛋白聚合物之間以及胞外多糖所在的空隙部分都處在不斷的動態變化中，這種動態環境使得蛋白簇更厚，網狀結構的重組更快也更致密[25]。

2.4 影響因素

2.4.1 胞外多糖的性質及添加方式對兩者作用的影響 發酵過程中胞外多糖帶電情況、分子量[29]、添加方式等的都不同會對兩者作用產生影響。

中性胞外多糖多因為與蛋白聚合物的不相容性導致其通過空間位阻破壞蛋白的交聯，影響空間網狀結構的構建。李全陽等[30]用電子顯微鏡觀察不同酸乳凝膠的微觀結構，發現同樣的結果。酸性胞外多糖則可能因為帶負電，硫酸基團，或者高分子量導致與蛋白之間發生強的靜電作用，強化酪蛋白之間的交聯作用，使得胞外多糖與蛋白橋連后嵌入到網狀結構中，減少凝膠時間，增加凝膠強度。Maude等[31]將帶負電的胞外多糖添加至牛乳中，研究其對酸乳（通過添加葡萄糖酸內酯來對牛乳進行調酸得到）凝膠情況以及剪切處理后凝膠結構恢復的影響。研究發現pH近中性時，未吸附的胞外多糖分子會產生空間位壘，使得酪蛋白膠粒互相靠近，發生進一步的凝集，形成凝膠。pH繼續降低，帶電胞外多糖和蛋白因為帶電不同相互吸引，進一步影響酸奶質構。與一般酸乳相比，帶電多糖添加后的酸乳凝膠更易碎，剪切處理后凝膠的恢復能力也更差。

分子量不同的胞外多糖對兩者作用的影響主要因空間位壘不同實現。當胞外多糖分子較小（與酪蛋白膠粒大小相近或更小）時，形成的空間位壘較小，此時即使濃度較大，對酪蛋白凝集形成網狀結構的影響仍很小，所形成的酪蛋白簇較粗，網狀結構中網孔較大，酸乳的硬度也較大。相反，當胞外多糖分子較大時，其空間位阻效應明顯，使得蛋白簇較細，網狀結構中網孔較多、較小，酸乳的黏度較大[30]。

內源產生和外源添加胞外多糖也會因空間位壘產生方式的不同對酸乳質構產生影響。楊同香等[32]研究內、外源胞外多糖的存在對酸乳流變學特性的影響發現，內源產生胞外多糖的酸乳與外源添加胞外多糖的酸乳相比，其表觀黏度更高，剪切應力的變化更大，酸乳粘彈性更好。其膠體脫水收縮作用敏感性（STS值）小，持水力（WHC值）大，即乳清析出少，穩定性好。這是因為乳酸菌發酵過程中胞外多糖的不斷產生，空間位壘效應從無到有，從小到大，形成的網狀結構就會細密、連續。而外源添加胞外多糖后再發酵，胞外多糖在發酵前自身已形成空間網絡，對酪蛋白的凝集產生很強的排斥作用，使得酪蛋白只能形成不連續的空間網狀結構，最終酸乳的黏度較低。

2.4.2 蛋白的構成及濃度對兩者作用的影響 蛋白結構、濃度大小、種類、比例不同等會對蛋白和胞外多糖的作用產生影響，進而影響酸乳質構。

酪蛋白膠粒的表面不平滑以及空隙的存在，會為胞外多糖等分子的加入提供位置，外層的κ-酪蛋白存在電解質層，將決定吸引或是排斥附近的胞外多糖[33]。

發酵前牛乳中蛋白的含量越高，胞外多糖的產量也越高，酸乳的黏度也越高。Ayala-Hernandez等[34]研究了蛋白含量對乳酸乳球菌產胞外多糖與蛋白之間相互作用以及對酸乳流變學特性的影響，發現酸乳的黏度隨酸乳中乳清蛋白含量的增加而增高，其黏度的增高很可能是胞外多糖與蛋白之間的相互作用所致。

改變牛乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例會因發酵過程中兩者與胞外多糖作用的不同對酸乳的質構產生大的影響。Maude等[12]用電勢滴定法研究了幾種陰離子胞外多糖和蛋白相互作用的初始pH，發現中性胞外多糖和乳清蛋白、酪蛋白發生作用的初始pH分別在6.1，5.4左右。由此推斷：改變乳中乳清蛋白和酪蛋白比例，會影響酸乳發酵過程凝膠網狀結構的形成情況，影響酸乳的最終質構。

2.5 兩者作用對酸乳品質的影響

酸乳中存在胞外多糖時，胞外多糖會與蛋白發生作用，影響蛋白簇的聚合情況，進而影響酸乳網狀結構的構建，最終影響酸乳的品質。有胞外多糖存在的酸乳與不產胞外多糖的酸乳相比，剪切應力和滯后回線面積更大，黏度、持水力、凝膠強度也較強[35,36]。對酸乳微觀結構觀察[37]發現：胞外多糖存在時，酸乳網狀結構中孔較大、蛋白簇較厚、凝膠較密；而不產胞外多糖的酸乳結構中孔較小且單一，蛋白簇較薄。Prasannaa等[38]發現產胞外多糖的酸乳脫水縮合作用較弱，但硬度及儲能模量較高，酸乳形成了良好的多孔狀網狀結構。

3 結論及展望

①胞外多糖在乳酸菌進入對數后期及穩定期后產生，在酸乳凝膠化后開始與蛋白發生作用；②胞外多糖和蛋白之間的作用主要有空間位壘和靜電作用兩種；③胞外多糖的性質及添加方式、蛋白的構成及濃度等都會對兩者的作用產生影響；④兩者相互作用會對酸乳的質構、黏度、粘彈性、持水力、風味等產生較大影響。

之前的研究多集中在孤立的多糖—蛋白二元體系中兩者的相互作用[39]。近年來開始有利用流變學技術、光學分析、光散射技術、顯微技術等方法分析乳加工過程中蛋白和胞外多糖的相互作用[40]。目前關于酸乳發酵過程中兩者分子水平上的作用機制仍不明了，如何應用于乳品生產還有待進一步的研究。

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