液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙草中的游離氨基酸

馬 戎，鮑峰偉，馮文寧，解 民，張艷芳，陳偉華

（河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河北 石家莊 050035）

0 引 言

氨基酸是煙草中一類重要化學(xué)物質(zhì)，游離氨基酸與還原糖之間可以發(fā)生酶及非酶催化的棕色化反應(yīng)，生成多種具有烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯等雜環(huán)化合物。現(xiàn)已經(jīng)從煙草中分離得到的多種游離氨基酸主要可分為：芳香氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸），脂肪氨基酸（如天門冬氨酸、谷氨酸），雜環(huán)氨基酸（如脯氨酸、色氨酸）。這些眾多的氨基酸在煙草生長(zhǎng)和加工的不同階段會(huì)發(fā)生不同的變化，適量的氨基酸有助于提高煙氣勁頭和增加豐滿度。若氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強(qiáng)烈，這是由于在燃燒過(guò)程中氨基酸通常生成NH3等含氮化合物，個(gè)別氨基酸還產(chǎn)生HCN等危害健康的煙氣成分；若氨基酸含量太低，煙氣則平淡無(wú)味缺少豐滿度[1]。因此對(duì)不同時(shí)期氨基酸含量及其變化情況的分析，可以為卷煙配方、煙葉加料、調(diào)制、發(fā)酵程度等提供理論指導(dǎo)。

目前，煙草中氨基酸的測(cè)定一般采用液相色譜法[2-5]或氨基酸分析儀法[6-7]，但由于氨基酸本身不具備紫外或熒光吸收，用以上兩種方法均需要衍生化操作，從而帶來(lái)衍生效率、衍生副產(chǎn)物以及反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性等問(wèn)題；因此，本文采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)煙草中游離氨基酸進(jìn)行了測(cè)定，避免了衍生化步驟帶來(lái)各種問(wèn)題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀、Agilent 6430三重四級(jí)桿質(zhì)譜、KQ-500型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）、Elix Milli-Q超純水機(jī)（MILLIPORE SAS）、AB204-S型電子天平（METTLER TOLEDO）、LG10-2.4高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

甲酸（色譜純）、鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、乙腈（色譜純）、液氮、高純氮?dú)狻?0種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 LC-MS條件

色譜條件：色譜柱為XTerra MS C18（50mm×2.1mm×2.5μm）；進(jìn)樣量為 5μL；柱溫為25℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫條件為 A∶B=95∶5，流速 0.5mL/min。

質(zhì)譜條件：載氣壓力為0.6MPa；離子源溫度為350℃；載氣流量10 L/min；碰撞氣壓力為0.15MPa；電離方式為ESI；極性為正模式；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；采集時(shí)間為30min；毛細(xì)管溫度為350℃；碰撞氣壓力為0.15MPa；各化合物的母離子、解離電壓、子離子以及碰撞能量（CE）參見表1；其他參數(shù)由自動(dòng)調(diào)諧確定。

表1 各氨基酸的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

用0.1%的鹽酸溶液配制成各氨基酸濃度為0.1，0.5，2.5，10，50μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品處理

按YC/T 31制備試樣，準(zhǔn)確稱取0.5 g試樣于50mL三角瓶中，加入20mL 0.1%的鹽酸溶液，超聲萃取15min，將萃取液轉(zhuǎn)入10mL離心管中，10000 r/min離心5min，取上清液過(guò)0.22μm水相濾膜，待測(cè)。

2 討 論

2.1 萃取溶劑的確定

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，植物樣品中游離氨基酸的萃取溶劑主要有1%鹽酸、0.1%鹽酸、80℃蒸餾水、80%乙醇等，其中最常用的是0.1%的鹽酸溶液和80%的乙醇溶液。用上述兩種溶液對(duì)同一樣品分別萃取6次，結(jié)果如表2所示。

表2 不同種類萃取溶液的萃取效果

由表2可見，除Trp、Arg外，鹽酸萃取液測(cè)得的數(shù)值都高于乙醇；除Asn、Tyr、Lys外，鹽酸萃取液的變異系數(shù)小于乙醇。因此，認(rèn)為鹽酸溶液的萃取效果優(yōu)于乙醇溶液。分別試驗(yàn)了0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1%6個(gè)濃度的鹽酸溶液的萃取效果如圖1所示。0.1%的鹽酸對(duì)大多數(shù)氨基酸的萃取效果優(yōu)于其他濃度的鹽酸。因此，選擇0.1%的鹽酸為萃取劑。

2.2 稱樣量的選擇

為考察樣品量對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的影響，試驗(yàn)了5個(gè)樣品量，加入50mL萃取劑，每個(gè)樣品量重復(fù)6次，結(jié)果如表3所示。隨著稱樣量增加，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差逐漸減小，但0.5 g以后變化不大，且樣品溶液逐漸混濁，給后續(xù)操作帶來(lái)不便。因此，確定0.5g為稱樣量。

2.3 工作曲線、重復(fù)性與回收率

將5個(gè)不同濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行檢測(cè)，用各氨基酸的峰面積對(duì)應(yīng)其相應(yīng)的濃度進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程及其相關(guān)系數(shù)見表4，標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖如圖2所示。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次，所得測(cè)定結(jié)果信噪比的3倍即為定性檢出限，信噪比的10倍為定量檢出限。表5分別列出了20種氨基酸的定量檢出限和定性檢出限。結(jié)果表明：在樣品中氨基酸的含量范圍內(nèi)，響應(yīng)值與對(duì)應(yīng)的各氨基酸的濃度呈良好的線性關(guān)系。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，用最優(yōu)的前處理?xiàng)l件提取加標(biāo)樣品中的游離氨基酸，測(cè)定樣品溶液中各氨基酸的回收率見表5，樣品溶液中20種氨基酸的回收率均在86.4%～105.9%之間。

圖1 鹽酸溶液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

表3 稱樣量的選擇

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

表4 氨基酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

圖2 氨基酸標(biāo)樣多反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖

表5 方法的回收率、檢出限和定量限

選取3個(gè)烤煙煙葉、1個(gè)白肋煙煙葉和1個(gè)成品卷煙檢測(cè)氨基酸含量，結(jié)果見表6。數(shù)據(jù)表明烤煙的Met、Gln明顯高于白肋煙，白肋煙的Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Val、Ile、Lys、Arg 明顯高于烤煙，檢測(cè)樣品中Asn的含量顯著高于其他氨基酸，白肋煙20種氨基酸總量高于烤煙。

表6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)束語(yǔ)

建立了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定煙草與煙草制品中游離氨基酸的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，不需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，檢測(cè)結(jié)果的平均回收率為86.4%～105.9%，檢出限為 0.001～0.011μg/mL，綜上，該方法準(zhǔn)確、快捷、選擇性好，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

[1]閆克玉.煙草化學(xué)[M].鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2002：57-67.

[2]馮雷，陳章玉，王保興，等.柱前衍生化反相高效液相色譜法測(cè)定煙草中的游離氨基酸[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003（S1）：241-245.

[3]景延秋，高玉珍，魯平，等.反相高效液相色譜法在測(cè)定白肋煙煙葉游離氨基酸含量中的應(yīng)用 [J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（5）：502-505.

[4]李丹，黃龍，朱巍，等.反相高效液相色譜法測(cè)定煙葉中的游離氨基酸[J].煙草科技，2003（2）：20-24.

[5]程勇，陳玲，鄧曉春.柱前衍生HPLC法測(cè)定煙葉中20種游離氨基酸含量[J].煙草科技，2010（8）：34-40.

[6]YC/T 282—2009煙葉.游離氨基酸的測(cè)定.氨基酸分析儀法[S].

[7]張峻松，賈春曉，李炎強(qiáng)，等.煙草中游離氨基酸的自動(dòng)分析儀測(cè)定[J].煙草科技，2004（8）：26-32.