超細大氣礦物顆粒物界面反應及生物活性研究新進展

董發勤，劉明學，耿迎雪，譚 媛

（1.固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；3.西南科技大學環境與資源學院，四川 綿陽 621010；4.北京理工大學化學學院，北京 100081）

0 引 言

礦物粉塵是大氣顆粒物的重要來源和組成部分，其粒徑達到微-納米級時，由于巨大的比表面積，極高的化學活性，使得空氣中大部分有害元素和化合物會吸附富集在礦物粉塵上并運移。隨著礦物粉塵粒徑的減小，它在大氣中的停留時間和在呼吸系統的深度吸入附著率也會隨之增加。PM2.5指空氣動力學當量直徑Da≤2.5μm的大氣顆粒物，也稱細顆粒物。大氣納米顆粒物（NPs）是指空氣動力學當量直徑小于100 nm的顆粒物，因團聚和附著作用，它也是PM10和PM2.5的重要組成部分。天然氣溶膠中半徑小于1μm的球形粒子，大都是由氣體到微粒的成核、凝結、凝聚等過程所生成；而礦物粉塵多由礦物固體和可溶鹽液體的破裂等機械過程所形成，多呈稍粗點的不規則狀。目前，PM2.5及更細的NPs已成為國際大氣污染研究領域的熱點和前沿，我國在2012年2月發布的環境空氣質量標準中增設了PM2.5的濃度限值[1]。

大氣中PM2.5濃度的上升與咳嗽等呼吸道癥狀產生、肺功能減弱及哮喘的發病相關,另外PM2.5可進入血液系統，直接導致心血管等疾病。納米顆粒物由于微尺度效應、高比表面積和復雜的化學特性易透過血腦屏障、皮膚進入體內，通過血液循環到達人體其他器官和部位，更易于轉移，肺內大部分沉積粒子的誘變是由超細顆粒引起的[2]。礦物粉塵導致疾病的生物化學過程均發生在礦物表面或其附近，其中的關鍵因素便是礦物晶胞的界面，通過其界面性質、化學性質、帶電性以及力學性和尺寸大小、化學成分來對生物系統施加影響。目前國內外研究集中在對大氣顆粒物生成源特性分析以及風險管理進行評估，而對PM2.5以及更細的顆粒物如納米物質的生物活性與效應的研究較少，未對各類顆粒物自身界面與生化反應特性的生物響應納入研究內容。本文介紹了大氣超細顆粒物的表面活性基及界/膜作用研究新進展，側重于大氣超細礦物粉塵的界面反應及其生物活性機理。

1 超細顆粒物界面反應研究

大氣顆粒物界面反應主要探討大氣中各種有毒、有害離子或分子與超細顆粒物表面之間的反應速率與反應機制。顆粒物表面存在一些化學活性很強的表面功能基團，當它們與環境中其他物質發生作用時，會因其極性、荷電性和Lewis酸堿性不同而表現出不同的作用力和反應速率，進而控制有毒、有害物質在大氣、水體、沉淀物和生物體中的賦存形態、穩定性及遷移。目前在界面反應研究方面主要集中在材料、金屬元素、礦物生物的化學反應等方面，而對超細礦物粉塵及納米顆粒的界面反應研究國內外都很少。

1.1 超細顆粒物表面電性

帶負電性的粉塵易與生物大分子物質如蛋白質發生電性作用，從而進一步在細胞膜等生物大分子物質上發生脂質過氧化反應，破壞細胞膜的完整性,使其崩解而致病；或者中和維護蛋白質穩定的電性，使蛋白質分子易于相互凝聚沉淀而發生變性，失去其生物活性，導致生物膜損傷而致病。大多數礦物粉塵在中性水溶液中ξ電位為負，在酸性環境中，表面電位更負，如纖維坡縷石粉塵的表面電位為-14.1mV，被4mol/L HCl溶蝕后，其表面電位降至-23.9mV[3]。礦物粉塵表面的荷電性與其細胞毒性之間存在著一定的相關關系。

表面電荷同樣是影響納米顆粒生物效應的重要參數之一。進入機體后表面帶正電荷的納米顆粒較易被肺臟攝取，而帶負電荷的顆粒則容易被肝臟攝取[4]。納米二氧化硅顆粒帶負電，表面存在不同鍵合狀態的羥基及不飽和鍵，這使得納米二氧化硅顆粒具有較高的表面活性以及更強的誘導脂質過氧化、損傷抗氧化系統的能力[5]。目前關于納米顆粒的表面電荷對生物機體的危害尚缺乏系統性研究。

1.2 超細顆粒物表面基團

礦物粉塵的表面官能團具有較高的活性，這種活性常常表現為對其他物質具有一定的吸附能力。纖維礦物粉塵對有機試劑的吸附能力并不完全與有機試劑的偶極矩大小成正比，部分纖維礦物粉塵吸附有機試劑后表面基團發生變化，特別是表面氧自由基、OH-基團、Si-O-Si基團的變化。礦物粉塵表面官能團吸附了一定量的物質后，其表面官能團的活性將受到一定影響。

賀小春、董發勤等通過對礦物粉塵進行酸堿洗蝕處理，對比分析礦物粉塵表面活性基團。研究表明，水鎂石、石棉、海泡石、坡縷石等含有OH-基團，硅灰石、硅藻土含有-Si-O-基團。這主要是由于不同礦物表面物質組成和結構的差異，使其表面官能團種類和性質有較大差別，如硅灰石、硅藻土、斜發沸石沒有獨立的OH-，而纖維水鎂石只有單一的OH-基團，斜發沸石以H2O+形式為主，部分可以轉化為H+、NH4+或OH-。晶片剝離將使表面官能團裸露更多，其裸露和轉化與表面結構缺陷和解理有關，缺陷越發育，OH-（或H2O+）含量越高。酸蝕作用可以改變礦物纖維表面的OH-濃度及分布，增加表面的缺陷數量和空隙。堿蝕對海泡石和坡縷石及斜發沸石中的Si-OH等表面基團不起作用，但對Al-O、Al-OH有破壞酸性位的作用。酸堿蝕殘余物的表面基團有的已完全不同于原始粉塵的類型，如硅灰石、纖蛇紋石石棉等殘余物明顯向SiO2轉化。這對體內酸性環境如肺泡內、胃內或堿性環境如小腸部位的粉塵生物溶解殘余物有類比價值。

納米顆粒因其表面原子的晶場環境及結合能與內部原子不同，存在許多懸空、不飽和鍵，極易與其他原子結合而穩定，所以具有很高的化學反應性[6]。

1.3 超細顆粒物的體外生物溶解界面反應

目前對礦物/微生物相互作用研究盡管有酸解、絡解、堿解作用的提出，但對礦物粉塵與微生物的作用機制的主導內因仍不明了，還應包括降解（溶出、減溶、不溶）、轉變、遷移、沉淀、成核（礦化）整個過程。應重視礦物塵在體內有機/無機體系相互作用過程中的微生物活性、耐毒性、對酶促反應及激活條件的影響、粉塵加入后細胞內外滲透壓及胞液pH值變化，并詳細研究礦物活性結構態特征對微生物類別的適用性。對礦物粉塵的生物活性進行了較為系統的研究，特別是對礦物/巨噬細胞體、礦物粉體/人體Gamble體系、人體氨基酸-維生素體系、人體血清體系作用過程和產物及影響因素進行了系統研究。研究表明：礦物粉體陷入巨噬細胞的生物膜內并發生了反應，并在LDH、SOD、MDA、細胞無機離子出現異常反應，發現檸檬酸、草酸、酒石酸、石碳酸對Ca、Al、Si、Fe 有強螯合作用。

2 超細顆粒物生物活性研究

2.1 超細顆粒物自由基產生及其毒理學研究

可吸入顆粒物中自由基的種類有半醌類自由基、活性氧自由基（如羥基自由基、超氧陰離子自由基）。礦物粉塵產生的自由基主要來自兩方面：粉塵本身特殊的表面化學特征和吸附的過渡金屬元素而產生自由基，二次吸附的有機物衍生的自由基的深度和作用目前不清楚。粉塵刺激吞噬細胞而產生自由基，即粉塵進入機體后能激發吞噬細胞的呼吸爆發，形成活性氧（O2-·，H2O2，HO·）自由基。自由基產生后，主要作用于脂質、蛋白質、DNA，引起膜脂質過氧化、蛋白質氧化或水解、誘導或抑制蛋白酶活性、DNA損傷等。董發勤、賀小春等[3]對多種礦物粉塵釋放自由基，如我國北方大氣降塵液相自由基進行研究，結果表明礦物表面基團具有高度的活性，能與DNA和染色體發生直接或間接的相互作用，影響粉塵的生物效應。

國外主要研究大氣顆粒物（PM）和石英粉塵細胞毒性與自由基的因果關系。Briede等[7]研究了燃燒PM2.5顆粒物的毒性與自由基產生；Baher等[8]研究表明燃燒產生的細顆粒物所含的自由基能夠導致體外和大鼠體內毒素的產生，從而對肺產生不利影響；Valko等[9]指出顆粒物產生的自由基會引起氧化應激反應，造成細胞氧化還原平衡失衡和細胞癌變，自由基還能誘導呼吸道炎癥反應和其他病理的生理改變；余晨等[10]研究得出SiO2粉塵對成纖維細胞有遺傳毒性，在較小劑量時即可表現出明顯的具有濃度和時間依賴性的DNA損傷作用，損傷過程中有羥自由基的參與；馬貴晉等人[11]研究發現PM2.5會損傷內皮細胞，隨著PM2.5濃度加大，細胞內ROS水平升高，氧化應激水平升高（馬貴晉等[11]，表1）。

表1 不同濃度PM2.5染毒24h對人臍靜脈內皮細胞ROS 水平、HO-1 和 Nrf2 mRNA 表達水平的影響 1）（s）

表1 不同濃度PM2.5染毒24h對人臍靜脈內皮細胞ROS 水平、HO-1 和 Nrf2 mRNA 表達水平的影響 1）（s）

注：1）與對照組比較，aP＜0.01；數據為5次獨立實驗的結果。

Nrf2 mRNA表達水平對照組 156±4 0.68±0.06 0.948±0.008 PM2.5 0.1mg/mL 組 179±5a 0.72±0.06 0.941±0.074 PM2.5 0.2mg/mL 組 191±6a 0.74±0.05 0.991±0.064 PM2.5 0.4mg/mL 組 198±12a 0.74±0.01 0.996±0.040 PM2.5 0.8mg/mL 組 211±11a 0.81±0.04a 1.010±0.039組別 ROS水平（熒光灰度值）HO-1 mRNA表達水平

活性氧可能是納米顆粒產生細胞毒性的主要原因之一。Nel等[12]發現活性氧的生成和氧化應激反應是碳納米管引起細胞毒性的主要方式；Rahman等[13]發現反應活性很大的納米顆粒和細胞膜相互作用產生了活性氧物質，產生的氧化應激引起細胞膜脂質層的破裂，細胞內鈣穩態失去平衡，導致依賴于Ca2+離子濃度的核酸內切酶的活化，引起了細胞凋亡；暴露于納米顆粒下會提高內皮細胞的粘著性和改變血管內皮的膜結構，這種損傷很大程度上由于微血管中的活性氧的增加[14-15]。

2.2 超細顆粒物與人體正常菌群、生物大分子及細胞的相互作用研究

在人體皮膚、粘膜以及與外界相通的腔道，均存在著一定種類的微生物群，習慣上將其稱為正常菌群。粉塵或被細菌等微生物污染的粉塵進入人體后會與人體正常菌群發生聯合作用，并且PM有潛在的生物化學作用，活性較強，其含有的金屬離子（如Mg、Al、Fe等）能夠與酸、堿、鹽、有機物等發生反應，從而加速PM對生物體的毒性作用。

PM2.5能對染色體、DNA、基因等不同水平遺傳物質產生毒性作用，包括染色體結構變化、DNA損傷、基因突變等。對于PM2.5遺傳損傷的機制目前主要有氧化損傷機制和DNA加合物形成機制。PM2.5攜帶的某些有機成分，如PAH，是已知的潛在致癌物，它能與細胞DNA共價結合。除了PAH外，在PM2.5中檢測到的3-硝基苯并蒽酮（3-NBA）也能與細胞DNA形成加合物，DNA加合物可能激發了一系列復雜的過程最終導致基因突變和基因癌變，這可能是PM2.5遺傳毒性的另一種機制[16]。

若從表面性狀上看，納米顆粒的化學和生物活性應強于同種物質的微米級顆粒，其表面結合能和化學性顯著高于微米級顆粒。肖琳等[17]采用不同濃度的納米SiO2和常規SiO2顆粒對Hela細胞進12 h染毒，應用MTT法檢測細胞毒性效應。研究發現，較低濃度（≤0.2μg·μL-1）的納米 SiO2和常規 SiO2對Hela細胞無明顯細胞毒性（P＞0.05）；較高濃度時，納米SiO2（≥0.4μg·μL-1）和常規SiO2（≥0.8μg·μL-1）對Hela細胞具有明顯細胞毒性作用（P＜0.01），并且隨濃度增大細胞毒性增強；當濃度≥0.4μg·μL-1時，納米SiO2的細胞毒性明顯高于相同濃度的常規SiO2（P＜0.05）；研究證明納米顆粒較微米級顆粒對人體肺部上皮細胞A549有更大的毒性，納米白云石的毒素效應更為明顯（肖琳等[17]，圖1）。但是關于不同毒性反應的機理不是十分明確，可能是由于納米顆粒提高了進入細胞的能力[18-20]。

圖1 不同濃度納米SiO2和常規SiO2染毒后MTT法所測得的OD值（細胞活性）

納米顆粒除了容易進入人體器官深部之外，也可能比較容易通過血腦屏障和血睪屏障對中樞神經系統、精子生成過程和精子形態以及精子活力產生不良影響，還可能與生物大分子相互作用，使其正常的立體結構發生改變，導致體內遺傳物質的突變及一些激素和重要酶類喪失活性[21]。目前對納米顆粒的研究主要集中在納米顆粒毒性與其尺寸、形貌、表面修飾、濃度、制備方法及作用時間的關系上，對納米TiO2、SiO2、碳納米管、富勒烯和納米鐵粉等少數幾個納米物質的生物效應僅進行了初步的探索，納米粒子生物毒性的機理目前還不十分清楚，納米材料的生物安全性評價方面更缺乏完善的評價方法及相應的指標體系[22]。

3 結束語

顆粒物的表面活性基影響其生物效應，表面特性對細胞的損害和粉塵性疾病的形成起著至關重要的作用。從國內外研究現狀及發展趨勢來看，超細顆粒物的毒理學將成為一個重要的研究方向和研究熱點。要特別重視超細大氣礦物顆粒物如主體礦物細塵或納米塵粒（或兩者的混合）與重金粒子、有機污染物等混合體的界面反應機理與調控因素、自由基與毒性等級研究。

界面研究的關鍵是有選擇性地對界面上分子的結構、構像和動力學進行實驗測量表征、綜合分析和理論模擬。今后的研究應朝著采用顆粒學、環境礦物學、表面物理化學、生物學、有機配位化學、微生物學、免疫學、環境毒理學方面基本理論和實驗方法相結合的思路發展。運用界面化學、環境化學和生物膜化學為理論基礎，利用共聚焦熒光探針顯微鏡、非損傷測微技術、X射線細胞顯微成像技術研究有機/無機共存界面反應過程；利用色譜、電子順磁共振譜、X射線光電子能譜、激光拉曼探針光譜等先進的測試儀器研究顆粒物的活性與元素結構態、液相自由基的產生與釋放、在各種生物體系環境下的產物和界膜表面的配合物形成，探索超細顆粒物毒性作用本質并以此為突破口尋求生物或藥物解毒的方法。

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