膠束增敏熒光光度法測定兔血樣中阿霉素

錢 帆，付玉麗，程秀梅，廖秀林，楊秀培

（西華師范大學化學化工學院，四川 南充 637000）

0 引 言

阿霉素（DOX）是一種有效的抗癌藥物，被廣泛用于癌癥的化療，且已被美國藥典收錄[1]。在化療過程中，DOX有嚴重的副作用，當用量超過550mg/m2時，就會有大于18%的概率出現不可逆的心臟毒性[2]；因此，DOX在臨床上應正確使用并嚴格控制用量。應用一種簡單、快速且靈敏的方法進行監控及其藥物代謝研究也是非常必要的。圖1顯示了DOX的化學結構，其本身具有一定的紫外吸收及熒光性能。目前，測定DOX的方法有光譜法[3]、伏安法[4]、差示極譜法[5]、毛細管電泳法[6]及液相色譜法[7]等，其中，熒光法具有方便、快速的特點，被廣泛應用于眾多實驗室及醫療院所[8]。盡管熒光法測定阿霉素已有文獻報道[9-10]，但一般熒光法的靈敏度不能滿足臨床監測的實際需求；因此，許多學者對提高阿霉素熒光檢測的靈敏度進行了研究[11-12]。本文首次提出利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對阿霉素熒光強度的增敏作用，建立膠束增敏熒光光度法測定DOX的新方法，并應用于兔血樣的分析。

圖1 阿霉素結構

1 實驗部分

1.1 儀 器

RF-5301PC熒光分光光度計（日本島津公司），Waters液相色譜儀-熒光檢測器（美國沃特斯公司），pH酸度計（美國奧豪斯公司），電子天平（美國奧豪斯公司），智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司），離心機（上海盧湘儀）。

1.2 試 劑

鹽酸阿霉素（Sigma公司，USA），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、四丁基溴化銨、十二烷基磺酸鈉、磷酸鹽、乙腈、甲醇、無水乙醇（成都科龍化工試劑廠），十二烷基硫酸鈉（天津濱?？频匣瘜W試劑有限公司），硼酸（上海外崗化工二廠），所用試劑均為分析純或以上，實驗用水均為三次水。

1.3 標準溶液及兔血樣的制備

標準溶液的配制：配制質量濃度為1.0mg/mL的阿霉素儲備液，放置于4℃下保存。每次實驗前準確移取適量的儲備液，配制所需阿霉素標準溶液。

兔血樣的制備：將1.2mL兔血清移入5mL離心管中，加入一定量的阿霉素標準溶液，再加入1.2mL乙腈，于高速離心機中離心去蛋白。取離心后的上層清液，再加入CTAB和硼酸緩沖溶液-乙醇混合液定容，隨后進行測定。

1.4 實驗步驟

將一定量的阿霉素標準溶液、一定量的CTAB溶液和硼酸緩沖溶液加至10mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻后測定其熒光強度。用1mL的石英比色皿，以480 nm的波長激發，測定發射光譜的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 熒光波長的選擇

分別測定濃度為75ng/mL的阿霉素在硼酸緩沖溶液及CTAB-乙醇-硼酸緩沖液混合體系中的熒光光譜，如圖2所示。阿霉素的最大激發波長與最大發射波長分別為480 nm和593 nm。兩種體系看來，CTAB及乙醇的加入對最大發射波長沒有多少影響，但對阿霉素的熒光強度有明顯增強。本實驗選擇的激發波長與發射波長分別為480nm和593 nm。

圖2 阿霉素在不同體系中的熒光光譜

2.2 表面活性劑種類的選擇

分別比較了十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、四丁基溴化銨、十二烷基硫酸鈉和十二烷基磺酸鈉等表面活性劑對阿霉素（5.0 ng/mL）熒光強度的影響，如圖3所示。幾種表面活性劑中，CTAB對阿霉素熒光有增強作用，故選CTAB作為增敏劑。

2.3 CTAB濃度的優化

詳細考察了0～2.5mmol/L CTAB的濃度對阿霉素（7.5 ng/mL）熒光強度的影響，其他條件均為優化值。如圖4所示，當CTAB的濃度小于1.9mmol/L，阿霉素的熒光強度隨著濃度的增加先劇烈增大然后變緩，當CTAB的濃度大于1.9mmol/L，阿霉素的熒光強度隨著濃度的增加而降低。這可能是因為CTAB濃度在小于1.1mmol/L達到其膠束濃度值時，溶液中的游離氧對熒光強度有一定的猝滅作用，隨著CTAB濃度的增加，溶液中的游離氧則逐漸下降，從而減小了溶解氧對熒光的猝滅作用；濃度大于1.1mmol/L后，CTAB濃度大于其臨界膠束濃度而在溶液中形成膠束，降低了阿霉素分子活動的自由度，從而減少了與其他溶劑或溶質分子的碰撞猝滅作用；但當CTAB濃度大于1.9mmol/L時，可能體系過高的黏性導致熒光強度反而下降。因此，CTAB的最佳濃度確定為1.9mmol/L。

圖3 不同表面活性劑對阿霉素熒光強度的影響

圖4 CTAB的濃度對阿霉素熒光強度的影響

2.4 緩沖溶液的pH值及濃度對阿霉素熒光強度的影響

本實驗對硼酸緩沖液的pH值及濃度作了考察。圖5和圖6分別顯示了硼酸緩沖液pH值及濃度對阿霉素（5.0 ng/mL）熒光強度的影響，其他條件均為優化值。當pH值小于6.0時，熒光強度隨著pH的增大而增大，當pH值大于6.0時，熒光則逐漸的降低。這是因為阿霉素在堿性及過酸條件下不穩定，堿性過強時甚至結構會被破壞，因此，在隨后的實驗中，6.0作為緩沖溶液的最佳pH值。從圖6可以看出，緩沖液濃度為17mmol/L時可以得到最大熒光強度；因此，選擇17mmol/L pH為6.0的硼酸緩沖溶液進行實驗。

2.5 乙醇含量的影響

實驗中發現添加一定的乙醇會增強阿霉素的熒光，隨后考察了乙醇含量（0%～80%，v/v）對阿霉素（10.0 ng/mL）熒光強度的影響，其他條件為優化值，如圖7所示。在含量為60%以下時，阿霉素的熒光隨乙醇含量的增加而增強，然而當大于60%時，阿霉素熒光急劇減弱；因此，乙醇含量確定為60%（v/v）較為適宜。

圖5 緩沖液pH對阿霉素熒光強度的影響

圖6 緩沖液濃度對阿霉素熒光強度的影響

圖7 乙醇含量對阿霉素熒光強度的影響

2.6 線性范圍與檢出限

在480nm的激發波長下，測定不同濃度的阿霉素混合體系（pH=6.0，17mmol/L硼酸緩沖液含60%乙醇（v/v）、1.9mmol/L CTAB）。得到標準曲線方程為

式中：F——體系熒光強度；

c——阿霉素濃度，ng/mL。

線性范圍為0.5～120 ng/mL，測得檢出限為0.161ng/mL（3S/N，n=10）。該靈敏度比同類文獻[13]報道的6.3×10-8mol/L約提高了兩個數量級。

2.7 加標回收率的測定

兔血取于市場上健康的家兔，在實際兔血樣中沒有檢出阿霉素，因此將不同阿霉素加標量的兔血樣品進行去蛋白處理后，采用如上熒光法進行回收率測定試驗，結果如表1所示。其回收率在93.7%～105.6%之間，相對標準偏差RSD為1.1%～1.5%，說明該方法具有較高的準確度。

表1 加標回收率測定結果（n=5）

2.8 與高效液相色譜法對比

藥典[14]中收錄的阿霉素檢測方法為高效液相色譜-紫外檢測法，該方法靈敏度較低，其線性范圍的下限要大于新方法線性范圍的上限，無法很好準確的進行方法對比，因此本工作采用文獻[7]中報道的高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）來測定加標兔血樣品來對比驗證新方法的準確度。色譜柱為反相Nucleosil C18柱，流動相為甲醇與0.01mol/L磷酸鹽緩沖液的混合液（65∶35，v/v；pH 2.96），流速為2mL/min，檢測的激發波長與發射波長分別為480nm和593nm，進樣量為20μL。表2中給出了所提新方法及HPLC-FLD法對加標兔血樣的測定結果，證明了新方法可替代HPLC法用于臨床阿霉素含量的快速測定。

表2 CE及HPLC法測定加標兔血樣結果（n=5）

3 結束語

本文研究了硼酸緩沖液pH值及濃度、有機溶劑和CTAB濃度等條件對體系熒光強度的影響，建立了兔血清中阿霉素表面活性劑增敏熒光光譜測定方法。結果顯示，在硼酸緩沖液pH=6.0、濃度為17mmol/L且含 60%乙醇（v/v）、1.9mmol/L CTAB 的條件下，體系熒光強度在0.5～120 ng/mL有良好的線性關系，且檢測限為0.161ng/mL，測定實際樣品的相對標準偏差為1.1%～1.5%，回收率在93.7%～105.6%，該法可用于臨床阿霉素含量的快速測定。

[1]De B E L，Bottone A E，Voest E E.Doxorubicin and mechanical performance of cardiac trabeculae after acute and chronic treatment：a review[J].Eur J Pharmacol，2001，415（1）：1-11.

[2]Herman A H，Rahman H，Ferrans V J，et al.Prevention of chronic doxorubicin cardiotoxicity in beagles by liposomal encapsulation[J].Cancer Res，1983，43（11）：5427-5432.

[3]Trevisan M G，Poppi R J.Determination of doxorubicin in human plasma by excitation-emission matrix fluorescence andmulti-way analysis[J].Anal Chim Acta，2003，493（1）：69-82.

[4]楊志潔，劉盛輝，葉建農，等.浸蠟石墨電極伏安法測定抗癌藥物鹽酸阿霉素[J].分析化學，1996，24（4）：471-474.

[5]譚學才，李啟隆，尚軍.阿霉素的示波極譜法[J].分析化學，1996，24（7）：764-767.

[6]Anderson A G，Gergen J，Arriaga E A.Detection of doxorubicin and metabolites in cell extracts and in single cells by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[J].J Chromatogr B，2002，769（1）：97-106.

[7]álvarez-Cedrón L，Sayalero M L，Lanao J M.Highperformance liquid chromatographic validated assay of doxorubicin in rat plasma and tissues[J].J Chromatogr B，1999，721（2）：271-278.

[8]許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].3版.北京：科學出版社，2006：1-2.

[9]趙剛，胡增華，黃力明，等.熒光光譜法測定人血漿中國產阿霉素濃度及臨床藥代動力學觀察[J].云南醫藥，1994，15（5）：377.

[10]閆繼東，辛華，鄭雅娟，等.應用熒光分光光度法測定血清及組織中阿霉素含量[J].中國實驗診斷學，2007，11（5）：596-597.

[11]趙一兵，馬學芳，郭祥群，等.阿霉素的熒光測定研究[J].廈門大學學報：自然科學版，1993，32（6）：753-757.

[12]李鳳云，陳浩然，趙鳳欣，等.熒光法測定阿霉素的血藥濃度[J].應用化學，2011，28（3）：343.

[13]張躍華，王南平，張其平，等.β-環糊精與阿霉素相互作用熒光光譜[J].黑龍江醫藥，1996，9（5）：243.

[14]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：693-694.