實時熒光定量PCR監測鎮江香醋醋酸發酵過程中微生物變化*

陶京蘭，陸震鳴，4，王宗敏，李國權，史勁松，2，許正宏，2，4

1(江南大學藥學院，江蘇無錫，214122)2(國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州，646000)3(江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇鎮江，214043)4(中國科學院天津工業生物技術研究所天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津，300308)

食醋是深受我國人民喜愛的一種酸性調味品。經過數千年的發展，食醋的生產遍及全國各地，其中以山西陳醋、鎮江香醋、四川保寧醋、福建永春老醋等最具代表［1－2］。中國食醋的釀造采用典型的多菌種混合發酵工藝，通過多種微生物的代謝作用產生風味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的發酵過程主要分為酒精發酵和醋酸發酵兩個階段。在酒精發酵階段，谷物原料如糯米、高粱等經過霉菌和酵母菌的一系列代謝，最終生成酒精;而醋酸發酵階段則是由多種細菌和真菌共同參與，將酒精轉化為醋酸的過程［3］，是決定食醋風味和品質的關鍵步驟［4－5］。前期研究表明，醋酸菌、乳酸菌和酵母是醋酸發酵過程的優勢功能微生物，在整個微生物群落中占到 80% 以上［6－8］，因此，監測發酵過程中醋酸菌、乳酸菌和酵母的生物量變化對于食醋發酵過程的控制以及提高產品的風味具有重要的生產意義。

實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光標記的特異性的探針，利用熒光信號累積對PCR產物進行標記跟蹤，實時監測整個PCR進程，最后結合相應的軟件通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［9］。該技術已經被成功用于復雜微生物群落中微生物的定量分析，如Persson等應用RT-qPCR特異性鑒定了都伯林沙門菌，并將其應用于食品質量控制［10］。在傳統發酵食醋的釀造微生物研究方面，已有學者采用微生物純培養技術、PCR-DGGE和克隆文庫分析技術等對食醋發酵過程中微生物群落的結構進行了解析［11－13］，但是微生物的定量數據報道較少。本研究采用RT-qPCR技術對鎮江香醋醋酸發酵階段的醋醅中總細菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母進行了定量分析，相關研究結果將為食醋釀造機理解析、發酵工藝過程控制奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

醋酸發酵過程的醋醅樣品取樣于江蘇恒順醋業股份有限公司，每天取樣1次。

RNaseA、蛋白酶K、瓊脂糖、Lysozyme溶菌酶，生工生物工程(上海)股份有限公司;HCl、EDTA、Na3PO4、CTAB、NaCl、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、無水乙醇，國藥集團股份有限公司;PCR試劑(Takara ExTaq、dNTP等)，EASY Dilution寶生物工程 (大連)有限公司;Ssofast Eva Green預混液、低位96孔無裙邊PCR反應板、96孔板黏性光學級封膜，美國BIORAD公司。

DNA 提取緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA鈉鹽，100 mmol/L磷酸三鈉，1.5 mol/L NaCl，1%CTAB ，pH 8.0。

TE 溶液:TE Buffer為 10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

1.2 實驗儀器

C1000 Thermal Cycler、CFX96實時定量PCR儀、核酸電泳儀，美國BIO-RAD公司;DyNA Quant 200核酸濃度測定儀，美國PHARMACIA BIOTECH公司;GDS凝膠成像系統，英國UVP公司;制冰機，日本SANYO公司;真空干燥儀，美國SAVANT公司。

1.3 醋醅總DNA的提取

醋醅總DNA提取采用改良的CTAB法。稱取2 g醋醅，用液氮充分研磨3～4次;向研磨的粉末中加入13.5 mL DNA提取緩沖液和100 μL蛋白酶K，37℃，225 r/min水平振蕩30 min;加入3 mL 10%SDS溶液和200 μL 50 mg/mL溶菌酶，65℃水浴2 h(中間顛倒混勻數次);室溫離心(6 000×g，10 min)，并收集上清液到50 mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)搖勻，4℃離心(6 000 × g，7 min)，收集上清液;加入0.6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1 h;離心收集沉淀(16 000×g，20 min);用預冷的70%乙醇洗滌沉淀，洗滌、離心(10 000×g，10 min)、干燥;加入 100 μL TE溶液和終濃度為 0.5 mg/mL RNaseA，37℃水浴2 h;－20℃保存。

提取的DNA樣品適當稀釋后采用核酸濃度測定儀確定DNA濃度，分析A260/A280評價DNA純度，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的降解程度和RNA消化情況。

1.4 RT-qPCR特異性引物設計

針對醋醅中總細菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母分別設計特異性引物(表 1)［3，14］，用于 RT-qPCR擴增。

表1 微生物特異性引物的名稱及序列Table 1 Names and sequences of specific primers

1.5 醋醅微生物的RT-qPCR定量分析

RT-qPCR反應體系:Ssofast Eva Green Mix 10 μL，引物各 1.0 μL，模板 10 ng，加 ddH2O 至 20 μL。

RT-qPCR反應程序:95℃ 10 s;95℃ 5 s，最佳退火溫度(表1)10 s，40個循環。然后體系從65℃升溫至95℃，每隔0.5℃讀一次板，每次維持0.05 s，繪制熔解曲線。

微生物的定量采用絕對定量法，即采用已知濃度的標準品制作標準曲線，對未知濃度的樣品進行其拷貝數的測定。標準品為含有目的片段的單拷貝克隆質粒［15］。標準品濃度計算:

其中:c標，標準品濃度(copies/μL);OD260nm，由核酸濃度測定儀3次測定的平均值;A，換算系數0.05，即1 OD260nm=0.05 μg/(μL dsDNA);N，稀釋倍數;6.02×1023，阿佛加德羅常數。

對標準品進行10倍梯度稀釋，然后以標準品為模板進行RT-qPCR反應。反應完成時，以閾值循環數Ct(即每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數)作為橫坐標，標準品濃度的對數作為縱坐標繪制標準曲線。

以醋酸發酵過程中不同時間的醋醅樣品總DNA為模板，進行RT-qPCR特異性擴增，并根據標準曲線計算醋醅中各類微生物的拷貝數。

2 結果與分析

2.1 醋醅樣品總DNA的提取分析

采用改良的CTAB法提取醋醅樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證結果(圖1)，核酸濃度測定儀測定其濃度(表2)，可知DNA電泳條帶都較整齊、清晰，均無明顯拖尾現象，表明總DNA完整且無明顯降解;A260/A280比值在1.8左右，總DNA質量較高，可用于RT-qPCR分析。

圖1 醋醅樣品總DNAFig.1 Total DNA of the vinegar fermentation culture M:λ-Hind III digest DNA Marker，1－19:total DNA of the vinegar fermentation culture samples

表2 醋醅樣品總DNA的A260/A280比值Table 2 A260/A280of total DNA of the vinegar fermentation culture

2.2 RT-qPCR反應的標準曲線及熔解曲線

本實驗中各類微生物的RT-qPCR擴增曲線為典型的倒S曲線，基線平整，指數區較明顯且陡度大，平臺區能夠匯于一起，線性范圍較寬。總細菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌、酵母的反應標準曲線及熔解曲線如圖2所示。熔解曲線呈現單一熔解峰，說明無引物二聚體及非特異性產物;曲線平穩，說明各濃度質粒的熔解溫度均一，擴增產物特異性好。標準曲線線性較好(R2=0.992 4～0.997 7)，標準品濃度范圍分別為:總細菌1.96×1012～1.96×103;總真菌6.18×1012～6.18×103;醋酸菌1.94×1012～1.94×103;乳酸菌6.92×1012～6.92×103;酵母菌8.18×1010～8.18 ×101。

2.3 醋酸發酵階段微生物生物量的動態變化

醋酸發酵階段各類微生物生物量的變化如圖3所示。發酵起始階段(1～7天)，醋醅中總細菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量快速上升，分別于第6、7、4天達到最大拷貝數，為4.85×1011，1.14×1010和3.37×1011copies/g干醅。隨后各類細菌的生物量逐漸下降，并維持在一定數量級(108～109)。醋醅中總真菌、酵母的生物量在發酵前期(1～7 d)變化不大，并維持在一定水平(107～1010)。總真菌的生物量在第7天后逐漸下降，由發酵起始的1.20×1010copies/g干醅下降為發酵結束時的7.59×104copies/g干醅，而酵母的生物量則在發酵8～12 d內下降為0。

由結果可知，醋酸菌和乳酸菌占醋醅中細菌總量的80%以上，是釀醋主體功能性微生物，兩者可利用酒精生成乙酸和乳酸等構成食醋主體風味的有機酸。另外，鎮江香醋采用分層翻醅的獨特釀造工藝，在發酵起始階段，醋醅的中、下層由于未翻醅而形成厭氧或痕量氧的環境，適合乳酸菌等兼性厭氧微生物快速繁殖，于第4天達到最大生物量，而醋酸菌等好氧微生物則在第7天達到最大生物量。醋酸發酵階段醋醅中的酵母主要來自于酒精發酵階段的酒醪，其具有發達的酶系，可在醋酸發酵過程中起到降解底物以及催化醋酸發酵時生成的有機酸與酒精發酵階段生成的醇類生成眾多酯類等風味物質。發酵第8天后酵母的生物量快速下降，可能是由于酸性環境的抑制作用所致。

3 結論

RT-qPCR具有速度快、特異性強、靈敏度高、交叉污染少、自動化程度高、全封閉反應以及定量準確等特點，目前已被廣泛應用于食品、醫藥和環境等研究領域。本文通過RT-qPCR的定量分析，證實了醋酸菌、乳酸菌和酵母為醋醅中的主體微生物，三者占細菌和真菌總和的80%以上。醋酸發酵階段醋醅中總細菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量均呈現先上升后下降至一定水平的變化趨勢。其中，醋酸菌和乳酸菌的生物量分別在第7天和第4天達到最大拷貝數，為細菌中主要微生物。總真菌和酵母在發酵起始階段變化不大，總真菌的生物量在第7天后逐漸下降，而酵母的生物量則在發酵8～12 d內下降為0。醋酸菌、乳酸菌和酵母作為醋酸發酵過程中的主要微生物，其功能有待進一步研究。

圖2 標準曲線及熔解曲線Fig.2 Standard curve and melting curve of the microorganism

圖3 醋酸發酵過程中微生物動態變化曲線Fig.3 Dynamic curve of the microorganism during the fermentation process

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