促紅細胞生成素在人乳腺癌細胞株中的表達及作用

晉雯，張小容，孔令英

(福建醫科大學病理學系，福建福州350004)

重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rh-EPO)于1986年應用于臨床，主要用于腫瘤相關性貧血、鐮刀形紅細胞貧血、重大整形外科手術伴發貧血等疾病的治療。但Bennett 等［1]2008年的薈萃分析顯示，EPO 類藥物可使靜脈血栓栓塞(VTE)危險增加57%，死亡危險增加10%，但是增高的死亡危險并不能用增高的VTE 發生危險來解釋。EPO 類藥物影響患者生存的確切機制還不清楚。最近一些研究表明［2]，EPO 及其受體(EPO-R)在多種惡性腫瘤組織中表達，且與刺激腫瘤增殖、抑制凋亡，促進腫瘤血管形成等有關，所以EPO類藥物在癌癥患者應用中的安全性令人堪憂。但目前對此存在很大的爭議，因此，有必要進一步研究rh-EPO 在調控腫瘤生長、血管生成和凋亡中的機制。本實驗選擇合適的rh-EPO 濃度作用于乳腺癌細胞，檢測后者增殖、凋亡及轉移等生物學行為的變化，探討EPO、EPO-R 在乳腺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7 細胞購自上海中科院細胞庫，MDA-MB-231 細胞株由福建醫科大學藥理學實驗室提供。DMEM 培養基、L-15 培養基、10%胎牛血清(Hyclone 公司);Trizol 液(Invitrogen 公司)，逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)，PCR 試劑盒(北京博邁德公司)，EPO、EPO-R 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成;兔抗人EPO 多克隆抗體(Abcam 公司)，鼠抗人EPO-R 單克隆抗體(Abcam公司);EnVision 試劑盒(邁新公司);配膠試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，甲基噻唑藍四氮唑鹽(MTT)為Biosharp 公司產品，ELISA 試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，rh-EPO(益比奧，沈陽三生制藥有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231細胞均為單層貼壁細胞，在37 ℃，5% CO2環境下常規培養。MCF-7 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養液培養，MDA-MB-231 細胞使用含10%胎牛血清的L-15 培養液培養，穩定傳代2d 后備用。

1.2.2 免疫細胞化學檢測EPO 和EPO-R 蛋白的表達 人乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細胞經細胞爬片后，采用EnVision 方法檢測EPO 和EPO-R 蛋白的表達。胞質及胞膜有棕黃色顆粒為陽性。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測細胞EPO 和EPO-R 蛋白的表達 分別提取各組細胞總蛋白60 μg 行SDSPAGE 電泳，電轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入鼠抗人多克隆一抗EPO(1 ∶1000)，兔抗人單克隆一抗EPO-R(1 ∶1000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，加HRP 標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(均為1 ∶5000)，孵育2 h，洗膜后加ECL 發光液，X 線曝光顯影，β-肌動蛋白作為內參照。蛋白印跡條帶用SensiAnsys 軟件分析。

1.2.4 MTT 比色法檢測EPO 對乳腺癌細胞活性和生長的影響 將細胞密度分別為6 ×104/mL、1.5 ×105/mL，100 μL/孔的MCF-7 和MDA-MB-231 細胞，接種于96 孔板，37 ℃，5%CO2環境培養24 h。分別加入終濃度為1、10、100、200、300、400 U/mL 的rh-EPO。酶標儀測定570 nm 和630 nm 雙波長光密度值(D 值)。按公式計算藥物對細胞生長的增殖指數(PI):PI=實驗組D 值/陰性對照D 值。

1.2.5 TUNEL 法測定乳腺癌細胞的凋亡指數 細胞核出現棕色顆粒為陽性著色。凋亡細胞計數:隨機取高倍鏡下5 個視野計數，陽性細胞占視野中所有細胞的百分比即凋亡指數(AI)，取均值。

1.2.6 Transwell 遷移、侵襲實驗 消化收集MCF-7和MDA-MB-231 細胞，于小室上室內加入180 μL(含1 ×105個細胞)上述細胞懸液。實驗組加入含rh-EPO 的無血清培養液20 μL，使其終濃度為200、300、400 U/mL，陰性對照組為無血清培養液。下室加600 μL 含10%胎牛血清的培養液，置37 ℃，5%CO2遷移實驗培養24 h，侵襲實驗培養48 h。Giemsa染色，顯微鏡下觀察穿膜細胞，并隨機取高倍鏡下5個視野計數取均值。

2 結果

2.1 EPO 和EPO-R 蛋白的表達

乳腺癌MCF-7 細胞株和MDA-MB-231 細胞株均可見到EPO 和EPO-R 蛋白的表達，EPO 和EPO-R 蛋白的相對分子質量分別約為21000 和55000(圖1)。

圖1 蛋白質印跡法檢測EPO 和EPO-R 蛋白的表達Fig 1 The protein expression of EPO/EPO-R examined by Western blot

細胞質和細胞膜內可見呈棕黃色或棕褐色細顆粒(圖2)。

圖2 EPO 和EPO-R 蛋白在兩類細胞中的表達(免疫細胞化學染色×400)Fig 2 ICC staining of EPO and EPO-R from MCF-7 and MDA-MB-231 cells

2.2 EPO 對乳腺癌細胞活性和生長的影響

MTT 法檢測未經rh-EPO 處理的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231 細胞增殖活性，結果顯示，MCF-7 和MDA-MB-231 細胞的增殖指數分別為1.40 ±0.28、2.52±0.59，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)，MDA-MB-231 細胞增殖速度大于MCF-7 細胞。

MTT 法檢測經rh-EPO 誘導后乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細胞的增殖活性，結果顯示，rh-EPO對乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-231 均有增加細胞活性和促進增殖的效應，48 h 內影響不明顯(差別無統計學意義)，48 h 后呈時間劑量依賴性(圖3)，尤其以MCF-7 組明顯。再結合未經rh-EPO處理的MTT 實驗中已證實的MDA-MB-231 細胞增殖速度大于MCF-7 細胞，可以推斷rh-EPO 對MCF-7 的作用效果強于MDA-MB-231 細胞。

圖3 不同濃度rh-EPO 對MCF-7 和MDA-MB-231細胞增殖能力的影響Fig 3 The proliferation abilities of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after exposed to rh-EPO

2.3 兩種乳腺癌細胞的凋亡指數

TUNEL 檢測凋亡細胞的結果顯示，rh-EPO 處理MCF-7 和MDA-MB-231 乳腺癌細胞72 h 后并沒有抑制兩類細胞的凋亡。對照組、200 U/L 組、300 U/L 組、400 U/L 組4 組間凋亡指數差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

表1 兩種乳腺癌細胞株各組凋亡指數Tab 1 Apoptosis index of two breast cancer cell lines

2.4 各組細胞株遷移、侵襲能力的比較

Transwell 遷移實驗顯示，rh-EPO 能增加MCF-7和MDA-MB-231 兩種細胞株24 h 遷移的細胞數而且具有時間劑量依賴性，各組間差異均有統計學意義(P＜0.05，表2，圖4)。

表2 各組遷移細胞數的比較Tab 2 Comparison of the number of migrating cells in each group

Transwell 侵襲實驗顯示，rh-EPO 能增加MCF-7和MDA-MB-231 兩種細胞株48 h 侵襲穿過的細胞數，具有時間劑量依賴性，各組間差異均有統計學意義(P＜0.05，表3，圖5)。

圖4 促紅細胞生成素對乳腺癌細胞遷移力的影響(Gimsa 染色×200)Fig 4 Migration abilities of MCF-7 and MDA-MB-231cells after exposed to rh-EPO

表3 各組侵襲穿過的細胞數比較Tab 3 Comparison of the number of invasion through cells in each group

圖5 促紅細胞生成素對乳腺癌細胞侵襲力的影響(Gimsa 染色×200)Fig 5 Invasion abilities of MCF-7 and MDA-MB-231cells after exposed to rh-EPO

3 討論

促紅細胞生成素及其受體的主要作用是調節紅系的發生與發展。但是，近年多項研究報道了EPO及其受體的轉錄體和蛋白在許多腫瘤中也有表達，主要包括卵巢癌、前列腺癌、腎癌、舌鱗狀細胞癌、腦膜瘤等［3-7]。另外，Giatromanloaki 等［8]發現EPO/EPO-R 在子宮內膜癌中高表達，且腫瘤惡性程度越高，EPO/EPO-R 表達越高。Yasuda 等［9]研究證實EPO-R 在惡性肺組織中的表達高于正常肺組織，且對肺泡上皮的轉化可能具有誘導作用。然而，對于EPO 及其受體在乳腺癌組織中的表達和功能研究尚少。本實驗采用RT-PCR 技術和蛋白質印跡等方法對乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 中EPO 和EPO-R 的表達做了初步研究。結果顯示，無論在基因水平還是蛋白水平，兩種細胞株中均有EPO 和EPO-R 的表達，且EPO 及EPO-R 均定位于細胞質和細胞膜。通過MTT 比色試驗、TUNEL 法、Transwell 小室法觀察不同濃度rh-EPO 對這兩種細胞增殖、凋亡和轉移能力的影響，結果提示外源性的促紅細胞生成素有可能通過與EPO-R 結合作用于乳腺癌細胞，影響其生長。

本實驗采用MTT 法檢測rh-EPO 對乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-231 增殖能力的影響。結果顯示，48 h 后rh-EPO 在一定濃度范圍(1 ～400 U/L)內可以呈時間、劑量依賴性地促進乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-231 細胞的增殖，而48 h 內rh-EPO 對細胞的增殖促進作用不明顯，無統計學意義。與Peres 等［10]報道的神經膠質瘤細胞、Mirmohammadsadegh 等［11]在黑色素瘤MV3 細胞株中的實驗結果相一致，即通過腫瘤細胞體外培養的方法均觀察到外源性EPO 對腫瘤細胞有促增殖的作用。然而李勇等［12]在同樣的實驗中，卻得出相反的結論，提出EPO 沒有明顯的促進乳腺癌細胞株MCF-7生長和增殖作用。同樣的實驗方法、實驗對象，卻出現矛盾的結論，是否與實驗室的條件、儀器的敏感性及試劑來自不同廠家或批次有關呢?此外本實驗還發現，由于MCF-7 細胞自身的增殖速度弱于MDAMB-231 細胞，而加藥后兩株細胞的增殖率未見明顯差異(P＞0.05)，說明rh-EPO 對MCF-7 細胞(雌激素依賴低轉移)的作用強于MDA-MB-231 細胞(雌激素不依賴高轉移)。rh-EPO 對不同乳腺癌細胞株的影響差異是否與雌激素有關還需進一步研究。

腫瘤的進行性生長及生長速度，與腫瘤細胞的生成和死亡的比例有關。腫瘤生長過程中，由于營養供應和抗腫瘤反應等因素的影響，有些腫瘤細胞會死亡，并且常以凋亡的形式發生。本實驗采用TUNEL 法檢測rh-EPO 作用于這兩株細胞后的凋亡情況，結果表明，rh-EPO 沒有抑制乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 凋亡的作用。Sinclair 等［13]報道rh-EPO 在神經膠質瘤細胞、腎臟嗜鉻細胞瘤和心肌細胞及內皮細胞內并沒有發揮抑制細胞凋亡和保護細胞的作用，這與我們的研究結果一致。而Mirmohammadsadegh 等［11]研究發現rh-EPO 可以抑制黑色素瘤細胞MV-3 的凋亡。提示在不同腫瘤細胞中rh-EPO 干擾后的病理生理作用可能存在差異，有待進一步研究。

侵襲和轉移是乳腺癌細胞的兩個重要的生物學特征，是瘤細胞從原發瘤脫離后向周圍組織間隙和(或)遠處組織運動轉移的過程，包括瘤細胞穿過細胞外基質(excellular matrix，ECM)屏障、血管壁基膜(basement membrane，BM)、穿出血管壁進入宿主微環境以及腫瘤細胞的移動等環節。本研究采用Transwell法檢測不同濃度rh-EPO 作用24 h 和48 h后細胞的遷移和侵襲能力。研究結果顯示，rh-EPO呈劑量依賴性地增強MCF-7 細胞和MDA-MB-231細胞遷移運動能力和侵襲出聚碳酸酯膜的能力。而在MTT 實驗中已證實在48 h 內rh-EPO 對細胞的增殖促進作用不明顯。這說明rh-EPO 在48 h 范圍內對細胞體外遷移及侵襲運動能力的促進作用不受rh-EPO 對細胞增殖活性的干擾。Abhold 等［14]用rh-EPO 作用于頭頸鱗狀細胞癌UMSCC-10B 和UMSCC-22B 細胞株，結果表明rh-EPO 能顯著提高腫瘤細胞的增殖能力和侵襲轉移能力。Lopez 等［15]以及Hamadmad 等［16]的研究均提示rh-EPO 能促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲轉移能力，與本實驗結果一致。

綜上所述，無論在基因水平還是蛋白水平，MCF-7 細胞和MDA-MB-231 細胞均有EPO 和EPOR 的表達，且EPO 及EPOR 均定位于細胞質和細胞膜。rh-EPO 在不影響癌細胞凋亡的情況下，呈時間劑量依賴性地提高乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 細胞的增殖活性，并呈劑量依賴性地增強其遷移、侵襲能力。這就提示，在使用rh-EPO 治療惡性腫瘤的貧血過程中，rh-EPO 即可能參與了乳腺癌的侵襲和轉移過程，隨著病情的進展，進一步通過影響癌細胞的增殖作用來促進腫瘤生長，且這種促進腫瘤生成的作用與抑制細胞的凋亡可能無關。這也提示EPO/EPO-R 可能成為乳腺癌分子診斷的標志物和治療的新靶標。至于rh-EPO 通過什么機制促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力還需進行深入的研究。

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