西地那非對胃癌移植瘤小鼠髓源抑制細胞免疫活性的調(diào)節(jié)作用

蔣健，張尤歷，徐萍，朱立寧，蔣曉猛，徐岷

(江蘇大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在荷瘤小鼠脾臟、血液及腫瘤組織或者腫瘤患者外周血及腫瘤組織中聚集有大量的未成熟髓源抑制細胞(myeloidderived suppressor cells，MDSCs)，它可以通過多種機制參與腫瘤的免疫逃逸，促進腫瘤細胞生長［1]。西地那非是磷酸二酯酶5(PDE5)抑制劑，能抑制荷瘤小鼠中MDSC 介導的免疫抑制效應，增強機體抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長［2]。本研究建立小鼠胃癌皮下移植瘤模型，檢測荷瘤小鼠外周血MDSC、CD4+、CD8+細胞亞群的比例變化，觀察西地那非對荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，及對MDSC 免疫活性的影響，探討西地那非在抗腫瘤免疫機制方面所發(fā)揮的作用以及MDSC 在胃癌免疫逃逸中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 健康615 近交系小鼠18 只，SPF級，鼠齡6 ～8 周，雌性，體質(zhì)量20 ～25 g(購自中科院天津血液病研究所，合格證號:SCXK 津2009-0002)，飼養(yǎng)于江蘇大學實驗動物中心。

1.1.2 細胞株 小鼠前胃癌細胞株MFC(購自中科院上海生命科學院)。

1.1. 3 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、小牛血清(Gibco 公司，美國)，F(xiàn)ITC-anti-CD11b、PE-anti-Gr-1、anti-CD16/CD32、PE-anti-CD3、PE/Cy5-anti-CD8、FITC-anti-CD4 以及同型對照抗體(eBioscience 公司，美國)，西地那非(Pfizer，美國)。

1.2 荷瘤小鼠模型構(gòu)建

收集處于對數(shù)生長期的MFC 細胞，用1×PBS 調(diào)整細胞密度為1 ×107個/mL，取0.2 mL 細胞懸液皮下注射至615 小鼠的右側(cè)背部。建立皮下腫瘤模型。選擇接種后7 ～10d，腫瘤生長旺盛且無潰破的動物，脫頸處死后消毒操作部位皮膚然后切開，選擇生長良好的瘤組織置于無菌平皿內(nèi)(平皿內(nèi)放置少許生理鹽水或細胞培養(yǎng)液)。將腫瘤組織剪成2 ～3 mm3的小塊，向無菌套管內(nèi)塞入一小塊，接種于健康動物前腋窩皮下，接種后小鼠自由飲食飲水飼養(yǎng)，觀察成瘤后，每隔3d 用游標卡尺測量腫瘤的大小，記錄并繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積按照公式V=ab2/2計算，a 為腫瘤的最長徑，b 為垂直徑，長度單位mm。

1.3 分組及用藥

將18 只6 周齡雌性615 小鼠隨機分成3 組(每組6 只):正常對照組、荷瘤PBS 組和荷瘤西地那非組。建立MFC 荷瘤小鼠模型，接種移植瘤24 h 后荷瘤西地那非組每天給予西地那非灌胃(20 mg/kg)，荷瘤PBS 組每天給予等體積的PBS 灌胃。28d 后(腫瘤生長至直徑1 ～2 cm 時)，摘眼球取外周血約0.4 mL 左右，處死小鼠，再剝離腫瘤、稱重，計算抑瘤率，公式:(荷瘤PBS 組小鼠平均瘤重-荷瘤西地那非組小鼠平均瘤重)/(荷瘤PBS 組小鼠平均瘤重)。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞比例

1.4.1 MDSC 比例 取外周血100 μL 加入到流式管中，每個管中加入CD16/CD32(1 μg/mL)冰上封閉20 min，PBS 洗滌后依次加入抗體熒光標記抗體FITC-anti-CD11b、PE-anti-Gr-1 各2 μL，2 ～8 ℃避光孵育30 ～60 min。加入2 mL 1 ×紅細胞裂解液，輕柔混合后避光室溫孵育10 min，PBS 洗滌后適量流式染色緩沖液重懸染色細胞并流式分析。

1.4.2 CD4+、CD8+淋巴細胞比例 取外周血100 μL 加入到流式管中，每個管中加入熒光標記抗體CD3-PE、CD4-FITC、CD8-PE/Cy5 各2 μL，2 ～8 ℃避光孵育30 ～60 min。加入2 mL 1 ×紅細胞裂解液，輕柔混合后避光室溫孵育10 min，PBS 洗滌后適量流式染色緩沖液重懸染色細胞并流式分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，采用兩獨立樣本t 檢驗進行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌MFC 荷瘤小鼠腫瘤生長情況

615 小鼠在胃癌移植瘤接種后每隔3d 測量腫瘤體積，第6 天左右開始可在體外觸及米粒至黃豆大小的腫塊，第18 天后隨著腫塊繼續(xù)增大，小鼠開始出現(xiàn)不同程度的消瘦、豎毛、精神不振、活動量減少，成瘤率為100%。

2.2 西地那非對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

西地那非能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，615小鼠的腫瘤生長曲線如圖1。荷瘤PBS 組小鼠和荷瘤西地那非組小鼠腫瘤的平均質(zhì)量分別為(2.78 ±0.57)g、(1.64 ±0.15)g，兩組小鼠腫瘤體質(zhì)量之間的差異有統(tǒng)計學意義(t =4.779，P＜0.05)。西地那非組干預28 天后的抑瘤率為41.2%。

圖1 615 荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線Fig 1 Tumor growth curve of 615 tumor-bearing mice

2.3 西地那非對荷瘤小鼠外周血MDSC、CD4+、CD8+T 細胞比例的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，荷瘤PBS 組比正常對照組小鼠外周血MDSC 比例升高(P＜0.05)，而荷瘤西地那非組比荷瘤PBS 組小鼠外周血MDSC 的比例下降(P＜0.05)。見表1、圖2。荷瘤PBS 組比正常對照組小鼠外周血CD4+/CD8+比值下降(P＜0.05)，荷瘤西地那非組比荷瘤PBS 組小鼠外周血CD4+/CD8+的比值升高(P＜0.05)。見圖2、表1。

2.4 MDSC 比例與CD4+ /CD8+比值相關(guān)性分析

采用Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在荷瘤小鼠的外周血中MDSC 比例與CD4+/CD8+比值存在顯著負相關(guān)(r=-0.858，P＜0.01)。見圖3。

圖2 MDSC、CD4 +、CD8 +T 細胞比例流式細胞術(shù)分析Fig 2 Percentages of circulating MDSC、CD4 +T and CD8 +Tdetermined by flow cytometry

表1 各組外周血MDSC、T 淋巴細胞亞群檢測結(jié)果±sTab 1 Test results of circulating MDSC and T lymphocyte subsets in all groups

表1 各組外周血MDSC、T 淋巴細胞亞群檢測結(jié)果±sTab 1 Test results of circulating MDSC and T lymphocyte subsets in all groups

與正常對照組比較，a:P＜0.05;與荷瘤PBS 組比較，b:P＜0.05

分組 MDSCs 比例∕% CD4 +∕% CD8 +∕% CD4 +/CD8+25.75 ±4.49 74.72 ±3.45 22.53 ±2.96 3.33 ±0.66荷瘤PBS 組 67.10 ±4.11a 55.83 ±7.00a 38.71 ±7.45a 1.52 ±0.44a荷瘤西地那非組 55.92 ±5.76b 65.60 ±2.04b 29.24 ±2.28b 2.26 ±0.24正常對照組b

3 討論

MDSC 是一群異質(zhì)細胞，來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，可在腫瘤來源因子(TDFs)的作用下，通過多種機制抑制宿主抗腫瘤免疫，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。荷瘤小鼠體內(nèi)的MDSC 共表達髓系分化抗原Gr1 和CD11b(即Gr1+CD11b+細胞)，正常小鼠脾臟內(nèi)Gr1+CD11b+細胞數(shù)量很少，但在荷瘤小鼠脾臟內(nèi)Gr1+CD11b+細胞數(shù)量可以高達80%［3]。MDSC 參與誘導免疫耐受的機制為通過表達高水平的精氨酸酶1(ARG-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和活性氧(ROS)，抑制T 細胞介導的抗腫瘤免疫［4-5]。最近研究顯示MDSCs 表達的整合素-金屬蛋白酶7 能下調(diào)T 細胞表達L-選擇素，T 細胞不能有效遷移到能夠接受腫瘤抗原刺激的淋巴結(jié)，導致活化的CD4+和CD8+T 細胞數(shù)量減少［6]。在荷瘤小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出CD4+T 細胞減少、CD8+T細胞增加、CD4+/CD8+比值下降，此種現(xiàn)象也同時存在于胃癌患者的外周血中，并已經(jīng)得到驗證［7]。本研究發(fā)現(xiàn)在荷瘤小鼠外周血中MDSC 的比例較正常對照組升高，西地那非干預后其比例下降。

圖3 荷瘤小鼠外周血中MDSC 比例與CD4 + /CD8 +比值相關(guān)性Fig 3 Correlation of MDSC proportion and CD4 + /CD8 +ratio in the tumor-bearing peripheral blood

西地那非是磷酸二酯酶5(PDE5)抑制劑，能下調(diào)ARG-1 和iNOS-2 的表達，抑制MDSC 介導的免疫抑制效應，同時增加腫瘤部位激活的T 細胞的數(shù)量，減緩腫瘤生長速度，促進T 細胞抗腫瘤效應［8]。在黑色素瘤模型中，西地那非可以通過抑制炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、VEGF、S100A9 的分泌降低MDSC 數(shù)量，削弱MDSC 免疫抑制作用，提示西地那非有抗炎作用［9]。

本研究將MFC 胃癌細胞接種到615 小鼠背部皮下，建立小鼠皮下荷瘤模型，成瘤24 h 后給予西地那非灌胃，28d 后測量腫瘤體積，流式細胞儀檢測外周血MDSC 及CD4+/CD8+比例變化，結(jié)果顯示荷瘤小鼠比正常對照組小鼠外周血MDSC 比例升高，而西地那非干預后MDSC 的比例下降。荷瘤小鼠比正常對照組小鼠外周血CD4+/CD8+比例下降，西地那非干預后CD4+/CD8+的比例升高，表明胃癌移植瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤細胞可能通過誘導外周血MDSC 比例升高，致CD4+、CD8+T 細胞亞群比例失調(diào)從而抑制T細胞免疫。西地那非可抑制胃癌移植瘤小鼠腫瘤生長，并可能通過降低荷瘤小鼠外周血MDSC 的比例，提高外周血CD4+/CD8+的比例，削弱MDSC 的免疫抑制作用，部分恢復T 細胞免疫功能，延緩腫瘤生長。綜上所述，MDSC 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，西地那非可能通過抑制MDSC 數(shù)量，調(diào)節(jié)T 細胞亞群的比例，增強抗腫瘤免疫，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。

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