pp242對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響

張國(guó)君，劉卓剛*，張 哲

膀胱癌是泌尿外科常見(jiàn)的惡性腫瘤，手術(shù)切除作為常規(guī)治療方法已被廣泛使用，但手術(shù)對(duì)于晚期腫瘤效果不佳，因此，藥物輔助治療被寄予厚望。蛋白酶及其抑制劑與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且新的參與因子、蛋白酶及其抑制劑可作為多種腫瘤患者臨床治療的重要指標(biāo)［1］，因此，針對(duì)蛋白酶的抑制已成為腫瘤治療的新的重要靶點(diǎn)。pp242是一種新型的mTOR抑制劑，可以抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，如乳腺癌［2］、結(jié)腸癌［3］等，且具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制侵襲能力，抑制腫瘤血管生成等多種作用。本研究探討pp242對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞系的增殖及侵襲的影響，檢測(cè)pp242對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展可能起到的作用。

1 儀器與試劑

儀器:酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。試劑:pp242(美國(guó)Selleckchem公司);T24膀胱癌細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));CCK-8試劑盒(碧云天公司);transwell板(美國(guó)Corning公司);matrigel基底膜膠(美國(guó)BD公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)invitrogen公司);胎牛血清(美國(guó)TBD公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) T24細(xì)胞置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。pp242溶于DMSO，－20℃保存，使用時(shí)用RPMI-1640稀釋至需要濃度。對(duì)照組不加入pp242。處理組按實(shí)驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目不同加入50、100、200、500 nM pp242并分別接種細(xì)胞24 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加藥，每天換液。

2.2 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè) 采用CCK-8比色法，T24細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔加100 μL含105個(gè)細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)24 h后，每孔再加入100 μL培養(yǎng)液，使pp242終濃度為50、100、200、500 nM，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔并設(shè)對(duì)照孔(加細(xì)胞不加藥物)和凋零孔(加培養(yǎng)液不加細(xì)胞)，培養(yǎng)48 h后每孔加CCK-8 20 μL，再培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nm的吸光度值(OD值)。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%。

2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將matrigel按1∶3比例稀釋后，每孔40 μL均勻地鋪在聚碳酸酯膜上(24孔板，8 μm 孔徑)，37 ℃成膠30 min，置紫外燈照射過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)前再次成膠30 min。細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，用1640懸浮密度為 4×105/mL，每個(gè)小室內(nèi)200 μL細(xì)胞懸液，接種到成膠的小室內(nèi)，用含5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。聚碳酸酯膜下層加入600 μL的10%培養(yǎng)基加入每個(gè)孔的下層液中作為誘導(dǎo)物，培養(yǎng)24 h。用棉球擦去matrigel膠，將已經(jīng)穿膜的細(xì)胞用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定，20 min，4℃;洗2次，風(fēng)干加入結(jié)晶紫(0.1%)染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍。隨機(jī)5個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)，重復(fù)3次試驗(yàn)。侵襲抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞平均數(shù)/對(duì)照組穿膜細(xì)胞平均數(shù))×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測(cè)pp242對(duì)T24細(xì)胞增殖活性的影響 隨著藥物濃度的增加，對(duì)T24細(xì)胞有明顯的抑制效果，在 pp242濃度為200～500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖活性明顯下降(P＜0.01)，其余兩組與對(duì)照組相比，其對(duì)細(xì)胞的增殖活性影響不明顯(P＞0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 pp242干預(yù)后T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%，±s)

表1 pp242干預(yù)后T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%，±s)

注:*與前一濃度比較，P＜0.01

組別 濃度(μmol/L) 抑制率(%)對(duì)照組0 pp242 組 50 15.0 ±0.86 100 22.4 ±0.44 200 46.6 ±0.54*500 56.7 ±0.68*

3.2 transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pp242對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響 隨著藥物濃度的增加，對(duì)T24細(xì)胞侵襲有明顯的抑制，在 pp242濃度為 200～500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的侵襲能力明顯被抑制(P＜0.01)，其余兩組與對(duì)照組相比，其對(duì)細(xì)胞的侵襲能力影響不明顯(P＞0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 pp242干預(yù)后T24細(xì)胞侵襲能力的影響

4 討論

mTOR是一種細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的重要激酶，雷帕霉素是有效的 mTOR抑制劑。mTOR存在2種復(fù)合物:mTORC1和mTORC2。其中 mTORC2對(duì)雷帕霉素不敏感［4］。pp242是Shokat研究小組開(kāi)發(fā)的一種新型的mTORC抑制劑，作用于mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)，因此，能同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2的催化特性［5-6］。pp242較雷帕霉素能更充分地抑制4EBP-1的磷酸化，為研究mTOR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的地位提供了很好的方法［7］。

本研究中，CCK-8結(jié)果顯示，隨著pp242濃度的升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，即pp242對(duì)T24細(xì)胞株具有明顯的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。

腫瘤的惡性程度體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力［8］。因此，更好地抑制腫瘤的侵襲能力，也是控制腫瘤轉(zhuǎn)移的一種途徑。本研究通過(guò)transwell法檢測(cè)藥物作用后的腫瘤細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，pp242具有抑制T24細(xì)胞侵襲的作用，處理組與對(duì)照組相比，穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且呈劑量依賴性。筆者前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，mTOR復(fù)合物在膀胱癌發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。本研究證實(shí)，pp242作為 mTORC1和mTORC2的抑制劑，能抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力，是一種很有潛力的抗腫瘤藥物，其在mTOR信號(hào)通路中的作用機(jī)制是我們未來(lái)的研究重點(diǎn)。

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