碘酸鉀對杜氏鹽藻抗氧化能力的影響

于 濤，王曉燕，洪利亞，鐘韻山，徐仰倉

(天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津 300457)

海洋約占地球表面積的71%，蘊藏著豐富的生物資源，由于高壓、高鹽、低營養等特殊環境及海洋物種間的生態作用，再加上遺傳和代謝的特異性，使海洋生物產生多種不同于陸地生物的特殊產物．杜氏鹽藻是一種廣泛分布于海洋、鹽湖中的單細胞無壁的真核綠藻[1]，含有豐富的 β–胡蘿卜素、黃酮、甘油、維生素 E、亞麻酸、硒、葉酸、多糖等生理活性物質[2]，具有提高人體免疫力、清除自由基、防治腫瘤、心血管、老年性癡呆和白內障等疾病的功能[3]．不同培養條件下，杜氏鹽藻體內的生理活性物質含量差異很大．本文研究了含碘鹽培養下，杜氏鹽藻體內主要生理活性物質含量及清除自由基能力的變化，為提高杜氏鹽藻的藥用價值提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 藻種及培養方法

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)購自中國科學院水生生物研究所藻種室．將杜氏鹽藻藻種接入本次實驗所用培養液中培養．

培養液：鹵水，取自塘沽鹽場，過濾后用蒸餾水稀釋鹽度至 30‰．一次性添加營養鹽至下列濃度：NaNO30.4,mmol/L，尿素 0.2,mmol/L，KH2,PO40.1,mmol/L，檸檬酸鐵 0.01,mmol/L，NaHCO33.0,mmol/L．121,℃ 30,min 滅菌．培養溫度為 25,℃，光照度為 4,000,lx，光/暗周期為 16,L/8,D．培養時間為 10,d．處理組在培養初始加不同質量濃度的碘酸鉀．

1.2 提取及測定方法

1.2.1 β–胡蘿卜素的提取及含量的測定

參照張建華等[4]使用的方法，稱取鹽藻粉 0.5,g，置于 250,mL三角瓶中，加入丙酮–石油醚(體積比為3∶7)100,mL，封口，60,℃水浴浸提 2次，每次60,min，離心分離上清液，合并提取液，減壓濃縮至25,mL．在450,nm處測吸光度，并根據標準曲線計算其含量．

1.2.2 黃酮類化合物的提取及含量的測定

1.2.3 維生素E的提取及含量的測定

參照劉樹恒[6]使用的方法，用維生素E(Sigma公司，α–生育酚≥96)制作標準曲線．稱取鹽藻粉0.5,g，加入無水乙醇 50,mL，室溫浸提 60,min，9,200,r/min離心5,min，沉淀用50,mL無水乙醇再次提取60,min，合并提取液，減壓濃縮至25,mL．10,mL反應體系中包括20,mg/L NH4Fe(SO4)2溶液0.5,mL、pH 4.6的乙酸–乙酸鈉緩沖溶液 1.0,mL、樣品溶液2.0,mL、5–硝基–1，10–菲咯啉乙醇溶液 1.0,mL、10.0,g/L十六烷基三甲基溴化銨溶液 1.0,mL、H2O 4.5,mL，室溫反應10,min．在502,nm處測定吸光度，從標準曲線上查出維生素E含量．

采用核黃素–NBT還原法[7]．核黃素在光照下可以產生·，·可被 NBT 還原形成藍色物質，后者在 580,nm處有吸光值．3,mL反應體系中含有：提取液 0.1,mL，0.1,mol/L EDTA 0.2,mL，1.5,mmol/L NBT 0.1,mL，磷酸緩沖液(pH 7.8)2.55,mL，0.12,mmol/L核黃素 0.05,mL．25,℃下光照 10,min．在 580,nm 波長處分別測定樣品組吸光度(A1)和對照組吸光度(A2)，按照式(1)計算清除率．

1.2.5 羥自由基(·OH)的測定

·OH 由 Fenton反應產生，·OH 的測定采用水楊酸比色法，參照徐仰倉[8]使用的方法．5,mL反應體系中含有：10,mmol/L水楊酸 0.5,mL，0.4,mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)3.0,mL，或 0.4,mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.4)2.8,mL，提取液 0.2,mL，3.8,mmol/L Fe2+–EDTA溶液 0.5,mL，4,mmol/L H2O21,mL．25,℃反應 90,min后，用乙醚抽提 2，3–二羥基苯甲酸，在 510,nm 波長處分別測定樣品組吸光度(A1)和對照組吸光度(A2)，按照式(1)計算·OH清除率．

1.3 統計分析

利用t–檢驗對數據進行分析，每個數據是3次重復實驗的平均值．

2 實驗結果

2.1 碘酸鉀對杜氏鹽藻體內黃酮含量的影響

碘酸鉀對杜氏鹽藻體內黃酮含量的影響如圖 1所示．當培養液中碘酸鉀的質量濃度低于 2.0,g/L時，杜氏鹽藻體內黃酮的含量并沒有發生明顯的變化；當培養液中碘酸鉀質量濃度在 3.0～4.0,g/L時，杜氏鹽藻體內的黃酮含量明顯高于對照；當培養液中碘酸鉀質量濃度為 4.0,g/L時，黃酮含量為對照的126.3%；當碘酸鉀質量濃度為5.0,g/L時，黃酮的含量又基本回到對照水平．

圖1 碘酸鉀對杜氏鹽藻黃酮含量的影響Fig.1 Effect of potassium iodate on flavonoid content in dunaliella salina

2.2 碘酸鉀對杜氏鹽藻體內β–胡蘿卜素含量的影響

碘酸鉀對杜氏鹽藻體內 β–胡蘿卜素含量的影響如圖 2所示．碘酸鉀誘導杜氏鹽藻 β–胡蘿卜素含量累積的最佳質量濃度為 0.4,g/L，此時，β–胡蘿卜素含量為對照的121.6%．此后，隨著培養液中碘酸鉀質量濃度的增高，藻體內的 β–胡蘿卜素含量逐漸降低，碘酸鉀質量濃度為 1.0,g/L時，β–胡蘿卜素含量為對照的96.8%．

圖2 碘酸鉀對杜氏鹽藻β–胡蘿卜素含量的影響Fig.2 Effect of potassium iodate on beta-carotene content in dunaliella salina

2.3 碘酸鉀對杜氏鹽藻體內維生素E含量的影響

由圖 3可見：隨著碘酸鉀質量濃度的升高，杜氏鹽藻體內的維生素 E含量逐漸增高，碘酸鉀質量濃度為 0.4,g/L時達到最大值，為對照的 126.7%．此后隨著碘酸鉀質量濃度的增高，藻體內的維生素 E含量反而降低，當碘酸鉀質量濃度為1.0,g/L時，藻體內的維生素E含量降為對照的94.7%．

圖3 碘酸鉀對杜氏鹽藻維生素E含量的影響Fig.3 Effect of potassium iodate on vitamin E content in dunaliella salina

2.4 碘酸鉀對杜氏鹽藻提取物清除 ·、·OH的影響

以上結果表明，培養液中碘酸鉀質量濃度直接影響著杜氏鹽藻體內抗氧化劑的含量，其中刺激作用較大的碘酸鉀質量濃度為 0.4,g/L和 4.0,g/L．為了進一步驗證上述結論，檢測不同碘酸鉀質量濃度下杜氏鹽藻提取液清除·、·OH 能力的變化．核黃素在光照下可以產生·．杜氏鹽藻藻粉提取液(50%乙醇提取液)能部分清除反應體系中核黃素產生的·，清除率為 35.6%(圖 4)．杜氏鹽藻培養在含碘酸鉀的溶液中，其提取液清除的能力提高了．碘酸鉀質量濃度在 0～1,g/L 時，藻體清除·的能力與體內 β–胡蘿卜素和維生素 E含量的變化趨勢一致，碘酸鉀質量濃度為 0.4,g/L時，清除率最大，達到 59.8%(圖4)；碘酸鉀質量濃度在 1～5,g/L時，藻體清除·的能力與體內黃酮含量的變化趨勢一致，碘酸鉀質量濃度為 4.0,g/L時，清除率最大，達到 52.9%(圖 4)．觀測碘酸鉀對杜氏鹽藻提取物清除·OH的影響時得到了類似的結果(圖5)．

圖4 碘酸鉀對杜氏鹽藻提取物清除·能力的影響Fig.4 Effect of potassium iodate on the· free radical scavenging capacity of dunaliella salina extract

圖5 碘酸鉀對杜氏鹽藻提取物清除·OH能力的影響Fig.5 Effect of potassium iodate on the ·OH free radical scavenging capacity of dunaliella salina extract

3 討論與分析

已知杜氏鹽藻是一種重要的海洋藥用植物，含有豐富的 β–胡蘿卜素、黃酮、甘油、維生素 E、亞麻酸、硒、葉酸、多糖等生理活性物質，具有提高人體免疫力、清除自由基、防治癌癥、心血管、老年性癡呆和白內障等疾病的功能[2–3]．為了進一步提高杜氏鹽藻的藥用價值，本文以碘酸鉀為誘導劑，研究了其對杜氏鹽藻抗氧化能力的影響．結果表明，0.4,g/L的碘酸鉀能明顯提高杜氏鹽藻中β–胡蘿卜素和維生素E的含量(圖 2、圖 3)，4.0,g/L的碘酸鉀明顯提高了杜氏鹽藻中黃酮的含量(圖 1)．表明培養液中的碘酸鉀能提高杜氏鹽藻體內抗氧化物質的含量．體外實驗也表明碘酸鉀增強了杜氏鹽藻提取物清除和·OH的能力(圖 4、圖 5)．

自由基是存在于生物體內的一把雙刃劍，在正常濃度范圍內，它是機體的一種功能物質，維持著生命活動的正常進行．但當濃度較高時，則對機體有嚴重的損傷作用，最終導致各種疾病[9]．隨著年齡的增大，人體自身清除活性氧自由基的能力降低，體內活性氧的含量逐漸增高．因此，只有借助外來抗氧化物質的幫助，才能維持體內自由基的相對平衡[10]．碘酸鉀提高了杜氏鹽藻體內抗氧化物質的含量，說明碘酸鉀能增加杜氏鹽藻的藥用價值．

中藥材的有效成分常常是一些次生代謝產物，后者是衡量藥材品質的一個重要指標．因此設法提高次生代謝產物的含量是中藥材研究及生產者追求的目標．除基因工程手段外，改變生存環境也是誘導藥用植物次生代謝產物累積的重要措施[11–12]．碘酸鉀是一種氧化劑，當植物遭受由它引起的氧化脅迫時，植物體內的一些抗氧化保護系統被誘導，進而產生較多的抗氧化物質來對抗這種氧化脅迫．這可能是外源碘酸鉀提高杜氏鹽藻黃酮、β–胡蘿卜素、維生素 E含量的原因所在．

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