菊芋小孢根霉固態發酵纖溶酶的工藝優化

孫 哲，孫 瑤，王海寬

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

近年來我國心血管疾病的發病率大大增加，特別是腦血栓嚴重威脅我國人民的生命安全．因此如何防治，如何提高血栓病的防治水平，是醫藥學界亟需解決的問題．目前溶栓治療方法主要有 3種：外科手術療法、器械療法、藥物療法[1–2]．其中，外科手術見效快，可是手術操作復雜、費用高、有創傷、術后復發率也高[3]；器械療法受到一定的設備局限，其本身不影響血栓的凝血機制，并且作用時間短，所以需要與其他療法結合，一般不單獨使用；而藥物溶栓法是通過使用溶栓藥物，使血凝塊中的纖維蛋白降解成可溶物質促使循環再通[4–5]，它與外科手術相比費用低，與保守療法相比死亡率低．因此，研究廉價、溶栓效果好且安全的溶栓藥物具有重大的現實意義．

溶栓藥物來源廣泛，動物、植物、微生物都有產纖溶酶的相關報道．自1987年日本學者Sumi等[6]發現納豆激酶(Nattokinase，NK)以后，通過微生物發酵方式獲得廉價、高效纖溶酶的方法引起業內人士的興趣．1996年 Kim 等[7]從韓國傳統食品豆醬中分離到有纖溶活性的蛋白酶，命名為枯草激酶(CK)．杜連祥等[8]從南方小酒藥中發現具有纖溶酶活性的根霉(Rhizopus chiensis)12#，根霉纖溶酶僅作用于枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶的底物，而不作用于凝血酶、尿激酶和胰蛋白酶的特異性合成底物，底物專一性好．2011年，Choi等[9]從蛹蟲草中分離得到纖溶活性很強的溶栓酶，相對分子質量為 3.4×104，能充分降解血纖維蛋白的 α、β和 γ–γ鏈．同年，Mander等[10]從鏈霉菌(Streptomyces sp. CS624)中分離得到一種纖溶酶，其相對分子質量較小，為 1.8×104，N 端 15氨基酸序列為APNVDAIYLPQYRLS，與其他纖溶酶報道不同．2012年Rashad等[11]從生長在葵花籽油蛋糕上的念珠菌中分離得到一種高相對分子質量7.244×104的纖溶酶，被 Cu2+、Hg2+和碘乙酸完全抑制，但酶活力較強，是一種有潛力的溶栓藥劑．

本實驗室從酒曲中分離出一株可降解纖維蛋白菌株，經鑒定為菊芋小孢根霉．前期實驗工作已經證明該菌株所產蛋白酶為纖溶酶[1,12]．纖維蛋白平板實驗證明具有很強纖溶活性，作為新一代溶栓抗凝藥物具有開發潛能．由于菊芋小孢根霉在初始固態發酵培養基上產酶量僅為(83.46±8.34)U/g，產量低，因而本文對菊芋小孢根霉的固態發酵生產工藝進行研究，旨在提高酶產量．

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

由本實驗室從酒曲中分離得到菊芋小孢霉Rhizopus microspores var. tuberosus[1]．

牛血纖維蛋白原、凝血酶和瓊脂糖，Sigma公司；其余試劑均為分析純或生化試劑．

1.2 培養基與培養方法

斜面培養基：PDA培養基．保存菌種接入斜面培養基，29,℃恒溫培養5,d．

發酵培養基：麩皮 25,g，豆粕 25,g，加水 50,mL，121,℃滅菌 20,min．用無菌水將斜面上的孢子洗下，轉入裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，振蕩，計數．用滅菌后的雙層紗布過濾得到孢子懸液，將其接入滅過菌的發酵培養基中(孢子濃度 106,g-1)，29,℃恒溫培養 72,h．

1.3 粗酶液制備方法

發酵結束后，按 1∶5的比例向發酵物中加入無菌生理鹽水，充分振蕩，使發酵物均勻分散到生理鹽水中，4,℃浸提 5,h之后將浸提物在 8,000,r/min、4,℃條件下離心20,min，取上清液即為粗酶液．

1.4 酶活測定方法

纖維蛋白平板法，參考Astrup等[13]與Walton[14]方法，用尿激酶標準品作纖溶酶活性標準曲線，37,℃保溫 16,h，其回歸方程為 Y＝1.624,X–1.666，R2＝0.994，其中 Y為酶活力(U/mL)的常用對數，X為溶圈最大與最小直徑乘積的常用對數．取待測樣品10,μL點在血纖維蛋白平板上，37,℃保溫 16,h后測定溶圈最大與最小直徑，通過上述回歸方程計算待測樣品酶活力，再換算出每克干基酶活力(U/g)．

2 結果與討論

2.1 培養基優化

2.1.1 碳源的選擇

分別取麩皮、玉米粉、大米粉、面粉25,g，與25,g豆粕配制成不同碳源的發酵培養基，加水 50,mL，拌勻，29,℃發酵 72,h．按 1.4方法測酶活力，結果見表1．結果表明，麩皮作為碳源時酶活力最高，其活力為(134.57±13.26)U/g．

2.1.2 氮源的選擇

分別取大豆粉、豆粕粉、花生餅粉、棉子餅粉25,g作為氮源，另加入 25,g麩皮配制成不同氮源的培養基，其他條件同上，測得酶活力見表 2．結果表明，豆粕粉作為氮源時酶活力最高，為(201.46±20.14)U/g．

2.1.3 碳氮比的確定

以麩皮為碳源，豆粕粉為氮源，按比例1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1分別配制總量為 50,g的培養基，其他條件同上．不同碳氮比對產酶的影響如圖 1所示. 結果表明，當碳氮比為2∶1時產酶量達到最大，其活力為(254.64±25.32)U/g．

表2 不同氮源對產酶的影響Tab.2 Effect of nitrogen source on production of fibrinolytic enzyme

圖1 不同碳氮比對產酶的影響Fig.1 Effect of different carbon nitrogen ratio on production of fibrinolytic enzyme

2.1.4 培養基含水量對產酶的影響

水是生命生長所必需的，菊芋小孢根霉發酵也不例外，尤其是好氧固態發酵對水量的要求相對更高，少量的水不能保證微生物體內生化反應的正常進行，也就不能大量產酶；相反，水過量會使培養基黏稠，氧供應困難，不利于菌體生長．為確定最適宜的水含量，本實驗向每克干基中分別加水 0.5、0.75、1.00、1.25、1.5、1.75、2.00,mL，發酵后測其活力，結果如圖2所示．結果表明：培養基中加水 1,mL/g(干基)酶產量最高，最高活力為(289.76±28.98)U/g．

圖2 不同含水量對產酶的影響Fig.2 Effect of moisture of culture on production of fibrinolytic enzyme

2.1.5 培養基初始pH對產纖溶酶的影響

用HCl或者NaOH調節培養基，使pH在4～10范圍內，發酵后分別測酶活力，結果如圖 3所示．結果表明，當發酵培養基初始pH為5時，酶活力最高，達到(302.46±15.12)U/g．由于原始培養基 pH 為5.3，與最適pH接近，所以pH不用調節．

圖3 不同發酵初始pH對產酶的影響Fig.3 Effect of initial pH on production of fibrinolytic enzyme

2.1.6 無機鹽對產酶的影響

微生物在生長和產酶的過程中需要某些無機鹽和微量元素作為各種酶的激活劑或輔助因子，這些物質一般在較低且合適的濃度下才對產酶起促進作用，而在較高濃度下將會抑制產酶，因而很有必要研究常見無機鹽對產酶的影響，且需要確定其最適濃度．

選擇 CaCl2、MnSO4、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、NaCl、CuSO4、FeSO4進行單因素實驗，考察這些無機鹽對菊芋小孢根霉產生纖溶酶的促進作用．加入量為10,mmol/kg，結果見表3．

表3 無機鹽對產酶的影響Tab.3 Effect of inorganic salts on production of fibrinolytic enzyme

結果表明，MgSO4、(NH4)2SO4、FeSO4對產酶有很好的促進作用，故選擇這3種無機鹽進行正交優化實驗，確定其最佳加入量．正交實驗設計與實驗結果見表 4，通過分析可知，最優無機鹽配比為 MgSO410,mmol/kg，(NH4)2,SO4200,mmol/kg，FeSO43,mmol/g；觀察R值，可知(NH4)2SO4對產酶影響最大．

表4 正交實驗結果Tab.4 ,Orthogonal experiment results

2.2 培養條件優化

在以上實驗確定的最佳培養基(麩皮與豆粕比例 2∶1、初始 pH,5.0、含水量(干基)1,mL/g、MgSO410,mmol/kg、(NH4)2,SO4200,mmol/kg、FeSO43,mmol/kg)條件下進行以下實驗．

2.2.1 接種量對產酶的影響

向每克培養基中分別接入 2×106、6×106、107個孢子，測定酶活力的結果分別為(386.48±19.33)U/g、(468.34±23.42)U/g 和(349.58±17.48)U/g，表明接種量為 6×106,g-1時酶活力最高，為(468.34±23.41)U/g．

2.2.2 發酵時間對產酶的影響

在以上最佳條件下，分別發酵 48、60、72、80,h，結果如圖4所示．結果表明：發酵時間達到72,h產酶量最大，為(588.54±29.42)U/g．

圖4 發酵時間對產酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on production of fibrinolytic enzyme

2.2.3 發酵溫度對產酶的影響

在以上最佳發酵條件下，將配好的發酵培養基分別放置在 24、29、33、37、42,℃恒溫培養箱中進行發酵，72,h后分別測酶活力，結果如圖 5所示．結果表明：最佳發酵溫度為 29,℃，最高酶活力為(654.19±32.71)U/g．

圖5 發酵溫度對產酶的影響Fig.5 Effect of temperature on production of fibrinolytic enzyme

2.2.4 培養基厚度對產酶的影響

在以上最佳條件下，配制厚度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0,cm 的固態培養基，考察培養基厚度對產酶的影響，結果如圖 6所示．結果表明：當培養基厚度為 2,cm 時產酶量最大，達到(668.76±33.38)U/g．

圖6 培養基厚度對產酶的影響Fig.6 Effect of medium thickness on production of fibrinolytic enzyme

2.3 驗證實驗

在以上實驗確定的最佳培養基(麩皮與豆粕比例2∶1，初始 pH,5.0，含水量(干基)1,mL/g，MgSO410,mmol/kg，(NH4)2SO4,200,mmol/kg，FeSO4,3,mmol/kg)及最適培養條件(接種量 6×106,g-1，培養基厚度2,cm，29,℃恒溫發酵 72,h)下發酵菊芋小孢根霉，測得平均酶活力為(684.39±34.22)U/g，是未優化條件下產酶量的8.2倍．

3 結 論

菊芋小孢根霉最適發酵培養基配料組成及培養條件：麩皮與豆粕的比例為 2∶1；含水量(干基)為1,mL/g；初始pH,5.0，由于與原始pH接近，故不用調節；無機鹽加入量為 MgSO4,10,mmol/kg，(NH4)2SO4200,mmol/kg，FeSO43,mmol/kg，其中(NH4)2,SO4對產酶影響最大；孢子最佳接入量為 6×106,g-1，發酵時間為 72,h，發酵溫度 29,℃，培養基厚度 2,cm．在最佳條件產酶量大幅度提高，從開始的(83.46±8.34)U/g提高到(684.39±34.22)U/g，效果顯著，為進一步放大探索工業化產酶方法奠定了基礎．

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