里氏木霉發酵法制備纖維素酶粗酶液及其酶促打漿的應用

張正健，韓雨彤，陳蘊智，胡惠仁

(1. 天津科技大學包裝與印刷工程學院，天津 300222；2. 天津市制漿造紙重點實驗室，天津科技大學材料科學與化學工程學院，天津 300457)

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

里氏木霉(Trichoderma reesei)DWC11，天津科技大學微生物實驗室提供；思茅松 BKP，云南云景林紙股份有限公司提供．羧甲基纖維素鈉(CMC)、無水葡萄糖、乙酸鈉、硫酸鎂、冰醋酸、硫酸錳、鹽酸、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、氫氧化鈉、硫酸、亞硫酸氫鈉、苯酚、氯化鈷、氯化鈣、氯化鋅、氯化鉀、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、微晶纖維素、蔗糖、麥芽糖、麩皮、麥稈粉、檸檬酸鈉、檸檬酸、水楊素，市售．

恒溫培養箱，江蘇正基儀器有限公司；恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機，日本日立公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；紫外分光光度計，LabTech公司；Valley打漿機，陜西科技大學機械廠；真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；PFI磨，挪威制漿造紙研究院；肖伯氏打漿度儀，宜賓造紙廠；快速紙頁成形器，EStanit Gbmh公司；抗張強度測試儀、撕裂度測試儀、耐破度測試儀，Lorentzen & Wettre公司．

1.2 培養基和相關溶液的配制

1.2.1 培養基

里氏木霉試管斜面培養基：1,g CMC、4,g營養元素液、0.1,g微量元素液、2,g瓊脂，加入蒸餾水至總質量為 100,g，pH 6.0．里氏木霉種子發酵培養基：1,g葡萄糖、4,g營養元素液、1,g麩皮、0.1,g微量元素液，加入蒸餾水至總質量為100,g，pH 5.5～6.0．里氏木霉基礎發酵培養基：1,g麩皮、4,g營養元素液、0.2,g微量元素液、1,g碳源，加入蒸餾水至總質量為100,g．

1.2.2 相關溶液的配制

營養元素液：6.25,g檸檬酸鈉、12.5,g磷酸二氫鉀、5,g硫酸銨、1,g硫酸鎂和 0.5,g氯化鈣溶解后定容至100,mL．微量元素液：2.5,g硫酸亞鐵、0.98,g硫酸錳、0.83,g氯化鋅、1,g氯化鈷和 5,mL 2,mol/L HCl溶解后定容至100,mL．

1.3 實驗方法

在溫度 30,℃、搖床轉速 120,r/min條件下培養96,h，通過改變氮源和碳源種類、碳源加入量、麩皮加入量、微量元素液加入量和營養元素液加入量，以發酵粗酶液的吸光度為評價依據，系統考察上述各種條件變化對纖維素酶各組分酶活的影響．在考察加入量對產酶的影響時，其加入量是相對于培養基總量(含自身)的質量百分比．在一定溫度和 pH 條件下，1,mL酶液(1,g酶粉)每分鐘水解相應底物產生 1,μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量定義為 1個酶活單位．濾紙酶活(FPA)表示酶的總體活性、Cx酶活表示內切葡萄糖苷酶活性、C1酶活表示外切葡萄糖苷酶活性、Cb酶活表示 β-葡萄糖苷酶活性，對應的降解底物分別為 1,cm×6,cm 的濾紙、1% CMC溶液、50,mg脫脂棉球和 1%水楊素溶液．取一定量稀釋酶液，與相應底物反應一定時間，反應液經 DNS顯色，測定530,nm的吸光度，根據標準曲線(以葡萄糖為標準物)確定還原糖產生的量，從而確定出酶的活力，吸光度越大，表明酶活性越強．通過改變酶用量，考察其對打漿性能和紙漿物理性能的影響，具體方法見參考文獻[7]．

2 結果與討論

2.1 里氏木霉發酵培養條件對產酶的影響

2.1.1 氮源和碳源種類

1995年，建設部印發了《城市園林綠化企業資質管理辦法》和《城市園林綠化企業資質標準》，將園林綠化企業自此從建工企業中分離。2007年，建設部印發了《工程設計資質標準》，又將風景園林工程從市政公用行業脫離出來。2011年3月，風景園林學被批準為國家一級學科，與城鄉規劃學、建筑學形成三足鼎立之勢，風景園林行業的地位產生了巨大提升。但目前的城鄉園林綠化法規大多仍然設置在城市市政公用事業規體系之下，在生態文明建設日益重要的今天，缺乏一定的獨立性。

氮源和碳源種類對產酶的影響如圖 1所示．由圖 1(a)可以看出，氮源不同對各組分酶活有顯著影響，無機氮源以硫酸銨為最佳，有機氮源以牛肉膏為最佳．產酶高低依次是硫酸銨＞牛肉膏＞硝酸銨＞蛋白胨＞酵母膏＞尿素．以尿素為氮源，酶活很低，這是由于尿素使液體培養基的pH增加所致．硫酸銨所對應的各組分酶活都較高，并且價格較低，原料易得，故采用硫酸銨為培養基的氮源．

從圖 1(b)中可以看出，固體碳源的產酶效果要比可溶性碳源好，這是因為纖維素酶是誘導酶，受碳源種類的影響較大，纖維材料能夠產生更好的誘導效果．當采用思茅松 BKP和微晶纖維素為碳源時，各組分酶活都比以麥稈和堿處理麥稈為碳源時要高，這是因為麥稈和堿處理麥稈的木素和半纖維素含量高，阻礙了里氏木霉菌體與纖維的接觸，因此其產纖維素酶活性較低．由于本發酵所制纖維素酶最終目的是用于思茅松 BKP的酶促打漿研究，所以為了能夠獲得針對性更強的纖維素酶，本研究采用思茅松 BKP為發酵碳源．

圖1 不同氮源和碳源對產酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen and carbon sources on cellulase production

2.1.2 碳源加入量

碳源加入量對產酶影響較大，如果加入量過低，則不能夠提供菌體生長所需要的碳源量；如果加入量過高，會導致發酵液的固含量過高，不易搖動起來，從而導致溶氧量不足，菌體無法正常生長，最終使得產酶活性較低．碳源加入量對產酶的影響如圖 2所示．

圖2 碳源加入量對產酶的影響Fig.2 Effect of carbon source dosage on cellulase production

從圖 2中可以看出，當思茅松 BKP加入量為0.5%～1%時，FPA 和 C1酶活相對較高，當思茅松BKP加入量大于1%時，FPA和C1酶活明顯降低；當思茅松BKP加入量為0.5%～3%時，Cb和Cx酶活相對較高，當思茅松 BKP加入量大于 3%時，Cb和 Cx酶活迅速降低．這表明 FPA和 C1酶活受思茅松BKP加入量的影響較大，而Cb和Cx酶活受其影響較小．當思茅松 BKP加入量為 1%時，各組分酶活都達到最大值，因此本研究采用的思茅松 BKP加入量為1%．

2.1.3 麩皮加入量

麩皮加入量對產酶的影響如圖 3所示．可以看出，當麩皮添加量為 1%時，各組分酶活均達到最大值，隨著其加入量的繼續增加，活力反而逐漸下降，這說明麩皮添加量過大對發酵不利，因此在發酵過程中添加1%的麩皮來提高發酵產酶活力．

圖3 麩皮加入量對產酶的影響Fig.3 Effect of bran dosage on cellulase production

2.1.4 微量元素液加入量

微量元素液含有 Fe2+、Mn2+、Zn2+和 Co2+，這些金屬離子在一定的濃度下對纖維素酶的合成以及酶活性有促進作用，比如Fe2+離子在酶與底物之間起著連橋作用，從而更有利于底物與酶的活性中心必需基團的結合．但是，如果上述離子濃度過大，則對產酶有抑制作用．微量元素液加入量對產酶的影響如圖 4所示．

圖4 微量元素液加入量對產酶的影響Fig.4 Effect of microelement liquid dosage on cellulase production

從圖中可以看出，當微量元素液用量為 0.2%時，各組分酶活都達到最大，大于或小于 0.2%都對產酶不利，因此確定發酵培養基中的微量元素液加入量為0.2%．

2.1.5 營養元素液加入量

營養元素液中包含發酵所必需的氮源(硫酸銨)、磷酸氫二鉀-檸檬酸鈉緩沖溶液、Mg2+和 Ca2+．由于微生物在代謝過程中不斷地向培養基中分泌代謝產物，影響培養基的pH變化，對大多數微生物來說，主要產生酸性產物，所以在培養過程中常引起 pH的下降，影響微生物的生長繁殖速度．為了盡可能地減緩培養過程中 pH的變化，在配制培養基時，加入一定的緩沖物質可以起到調節pH的作用．營養元素液中的鉀、鈣和鎂離子還參與細胞結構物質的組成，并有能量轉移、細胞透性調節等功能．營養元素液用量對產酶的影響如圖5所示．

圖5 營養元素液用量對產酶的影響Fig.5 Effect of nutrition element liquid dosage on cellulase production

由圖 5可知，隨著營養元素液用量的增加，纖維素酶各組分酶活先上升后下降，在用量為 8%時均達到最高值．當用量小于 8%時，不能滿足菌體的生長所需，但是用量過大時則對產酶有抑制作用．因此確定發酵培養基中的營養元素液加入量為8%．

2.2 酶促打漿

在氮源(硫酸銨)0.2%、碳源(思茅松 BKP)1%、麩皮 1%、微量元素液 0.2%、營養元素液 8%，溫度30,℃、搖床轉速 120,r/min條件下發酵培養 96,h，其各組分酶活為：FPA 酶活 471.42,U/mL，Cx酶活3,083.19,U/mL，C1酶活 471.42,U/mL，Cb酶活為27.79,U/mL．通過改變酶用量，研究其在酶促打漿中的作用．

酶用量(按 FPA 酶活計算，下同)對紙漿打漿度和物理性能的影響見表 1．從中可以看出，在打漿時間均為 4,min的條件下，當酶用量在 0～5,U/g之間時，打漿度增加較平緩；酶用量大于5,U/g時，打漿度明顯上升，酶用量為 7,U/g時，打漿度比空白樣高出10,°SR．打漿度的增加是由酶解作用造成的．酶解作用使紙漿纖維細胞壁的結構受到破壞，使纖維產生內部和外部細纖維化，從而使其易于打漿．在相同打漿時間內，酶處理后的漿樣比空白樣的打漿度要高，酶用量越大提高程度越大，即在達到相同打漿度的情況下，酶處理后的漿樣能有效降低打漿時間，酶用量越大所需的打漿時間就越少，從而降低打漿能耗．

表1 酶用量對打漿和紙漿物理性能的影響Tab.1 Effect of cellulase dosage on beating degree and the pulp physical properties

在研究酶用量對紙漿物理性能的影響時，空白樣和酶處理樣都需達到同一打漿度，即控制在48,°SR．紙漿的物理性能的變化是纖維間結合力、纖維內在強度和纖維平均長度綜合影響的結果．從表 1中可以看出，抗張指數只在酶用量為 5,U/g時略有增加；耐破指數和撕裂指數隨著酶用量增加都呈逐漸下降趨勢，但下降的幅度都不大．因此，采用里氏木霉自制纖維素酶進行酶促打漿，不僅能夠有效地提高打漿性能，而且還能夠最大程度地保持紙漿的強度性能，這對降低酶促打漿生產成本、推廣其工業化應用具有一定實用價值．

3 結 論

里氏木霉發酵制備纖維素酶粗酶液的發酵培養條件如下：氮源(硫酸銨)0.2%、碳源(思茅松BKP)1%、麩皮 1%、微量元素液 0.2%、營養元素液8%，溫度 30,℃、搖床轉速 120,r/min，培養 96,h．隨著里氏木霉所制纖維素酶用量的增加，打漿度逐漸上升，思茅松 BKP的打漿性能得到明顯提高；紙漿的物理強度性能有所下降，但下降幅度不大．

［1］ 張繼泉，王瑞明，孫玉英，等. 里氏木霉生產纖維酶的研究進展[J]. 飼料工業，2003，24(1)：9–13.

［2］ Xu J，Nogawa M，Okada H，et al. Regulation of xyn3 gene expression in Trichoderma reesei PC-3–7 [J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2000，54(3)：370–375.

［3］ 胡彩靜，代淑梅，李秋園. 里氏木霉(Trichoderma reesei)產纖維素酶液態發酵條件的研究[J]. 食品與發酵工業，2005，31(9)：45–48.

［4］ 楊博，秦夢華，劉娜，等. 纖維素酶和木聚糖酶改善楊木 CTMP強度性能的研究[J]. 造紙科學與技術，2010，29(2)：59–63.

［5］ 張正健，胡惠仁，徐建峰，等. 漂白硫酸鹽思茅松漿酶促打漿的研究[J]. 中國造紙學報，2009，24(1)：35–41.

［6］ 劉姍姍，徐永建，王志杰，等. 纖維素酶處理對闊葉木漿打漿性能的影響[J]. 陜西科技大學學報：自然科學版，2009，27(6)：29–31.

［7］ 張正健，胡惠仁. 纖維素酶改性提高思茅松漂白KP漿打漿性能[J]. 中國造紙，2008，27(12)：1–5.