高溫影響番茄小孢子發育的細胞學研究

彭 真，程 琳，何艷軍，王 潔，關小燕，劉松瑜，盧 鋼

(浙江大學農業與生物技術學院園藝系，杭州 310058)

高溫嚴重影響植物的生長發育及生理代謝，已成為限制植物分布、生長和生產力的一個主要環境因子。大多數栽培作物(如番茄［1］、辣椒［2］、菜豆［3］、擬南芥［4］、水稻［5］、大麥［6］等)的生殖生長時期比營養生長時期對高溫更敏感，前人的研究表明這主要是因為花粉發育與萌發對高溫非常敏感［7-8］。番茄作為重要的園藝作物其產量和質量卻受到高溫或者低溫的影響。在日溫高于32℃的環境下生長的番茄植株其雄配子的發育與功能比雌配子更易受到影響，從而導致授粉受精不良、坐果率下降、果實品質變劣等［9-11］。

關于番茄高溫脅迫的影響，前人研究重點主要涉及高溫對番茄種子萌發和植株生長的影響、番茄耐熱性鑒定方法和高溫影響成熟花粉粒表達譜差異分析等諸多方面［12-14］，但對于持續高溫脅迫對番茄花粉小孢子發育影響的細胞與分子生物學研究尚未見報道。正常條件下的番茄小孢子發育過程的研究表明，絨氈層細胞在孢母細胞減數分裂時開始出現自溶跡象，而且同一花藥不同藥室內，孢母細胞減數分裂高度同步［15］。同時證實小孢子發育時期與花器形態密切相關［16-18］。本研究以番茄‘Micro-Tom’為材料，通過 DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)染色、石蠟切片等方法對正常情況下小孢子發育各時期進行劃分;并研究了高溫脅迫對番茄小孢子發育細胞學結構的影響，旨在探索高溫脅迫下小孢子敗育的細胞學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為番茄品種‘Micro-Tom’(Solanum lycopersicum L.)，由美國番茄遺傳資源中心(Tomato Genetics Resource Center，TGRC)本實驗室多代自交保存的穩定自交系。在基質(草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1)上培育的幼苗，種植于智能光照培養箱內，光照強度約為300 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h(光/暗)，空氣濕度保持在70%—85%。植株正常生長溫周期為(25±1)℃/(20±1)℃(晝/夜)，高溫脅迫處理的溫度為(35±1)℃/(30±1)℃。植株培育現第一花序時開始高溫脅迫，處理時間為7 d。對照組植株與熱處理組植株相比，除生長環境溫周期不同外，保證其他條件均相同。

1.2 方法

1.2.1 DAPI染色法檢測小孢子發育時期

進行番茄小孢子發育觀察和時期劃分的材料種植溫度為(25±1)℃/(20±1)℃。于開花期取處于不同發育階段的花蕾(圖1)，保持新鮮，用Leica體視顯微鏡拍照并測量花蕾長度。取不同發育階段的花藥，于潔凈載玻片上用手術刀橫切花藥并分離出小孢子，用1 mg/mL的DAPI溶液于黑暗環境下染色小孢子30 s，在Leica DMLB熒光顯微鏡下觀察小孢子發育各階段的形態，并用Zeiss CCD系統拍照記錄。

1.2.2 TTC染色法檢測花粉活力

9:00以前取花瓣初展開的番茄花蕾，放入培養皿中，并注意保濕，備用。將50 μL 0.5g/100mL濃度的TTC(Triphenyltetrazolium chloride)溶液滴到潔凈載玻片上，用手術刀橫切不同發育階段的花藥，放入載玻片上溶液中擠出花粉粒，加蓋玻片。將制片放入墊有濕吸水紙的培養皿，于37℃恒溫箱中，避光，放置90 min左右，然后取出制片，置于低倍顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。每份材料觀察不同植株上的3—4個花蕾，每一花蕾制一個制片，每片取5個視野，統計并計算花粉的活力百分率。

圖1 番茄‘Micro-Tom’小孢子發育各時期花蕾形態觀察Fig.1 Investigation of bud morphology of Solanum lycopersicum var.Micro-Tom during microspores development stages

1.2.3 花粉體外萌發法檢測花粉萌發力

上午9時以前取花瓣初展開的番茄花蕾，于體外進行花粉萌發實驗?；ǚ勖劝l液體培養基［19］各成分、工作濃度及培養基pH值分別為:蔗糖120 g/L，H3BO350 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 300 mg/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，KNO3100 mg/L，pH值=6.5。向液體培養基中添加瓊脂粉(終濃度為0.1%)使培養基有適量粘性，防止花粉粒在培養基上漂移到液滴邊緣，保證花粉粒能夠均勻分布。

對照花粉［CK(25℃)，Control Check］分別置于25℃和35℃溫度下萌發，高溫脅迫處理花粉［HS(35℃)，Heat Stress］也分別置于25℃和35℃溫度下萌發?；ǚ勖劝l60 min后在培養基上滴加20 μL 0.1g/100mL濃度的苯胺藍溶液對花粉管熒光染色3 min，然后在Leica熒光顯微鏡下鏡檢拍照，統計各處理的花粉萌發率。

1.2.4 石蠟切片

制作石蠟切片，觀察高溫脅迫前后番茄小孢子發育各階段的花藥、藥室、絨氈層、小孢子等的變化。分別取對照和高溫脅迫番茄的各級花蕾，固定于FAA固定液(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)中48 h，隨后將固定好的材料依次轉入50%、70%、85%、95%、100%乙醇中逐級脫水(各1 h)，然后經二甲苯徹底透明后，進行透蠟和石蠟包埋，包埋好的蠟塊放入4℃冰箱中保存備用。切片時制成厚度為8 μm的連續切片，用鐵礬-蘇木精法染色，中性樹膠干燥封片。Leica DMLB熒光顯微鏡觀察，并用Zeiss CCD系統拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 番茄花粉發育過程的細胞學特征

2.1.1 番茄花粉發育進程

番茄花蕾初期發育比較慢，從花芽開始分化到可見萼片，以及花瓣的發生大約需要10 d，到能觀察到初生的雄蕊又需要3 d左右。以后發育加快，雄蕊發育到花粉母細胞可見需要5 d，以后進行減數分裂形成四分體小孢子直到四分體小孢子分離而形成單核花粉粒大約需要4 d，單核花粉粒經過約3—4 d就可以形成完全成熟的花粉粒。

2.1.2 小孢子母細胞形成期至前減數分裂期

花蕾完全閉合，被萼片包被，呈綠色，有稠密絨毛，花蕾長度約2 mm(圖1 A)。剝離花被，可見各花藥獨立未形成花藥筒，呈淺黃綠色，透明。石蠟切片觀察，該時期花藥壁的各層已分化明顯。最外層是表皮，細胞小，具角質層，有保護功能。表皮下層近于方形的較大細胞為藥室內壁，內部1—3層較小的、呈切向延長的扁細胞，為中層。最內一層是絨氈層，為質濃、核大的長柱狀細胞，其功能是提供小孢子發育所需的營養物質。藥室呈馬蹄形，內含許多有棱的小孢子母細胞(圖1 a)。小孢子母細胞擁有一個較大的核(圖2 A)，并被具有雙核的絨氈層細胞所包圍。

圖2 番茄花粉小孢子發育各時期的DAPI染色觀察Fig.2 Investigation of tomato microspores development using DAPI staining

2.1.3 前減數分裂期至四分體時期

花蕾仍完全閉合，被萼片包被，呈綠色，蕾長2.5—3.5 mm(圖1 B)。各花藥相互靠近結合但未形成花藥筒，呈淺黃綠色，半透明，藥室內空間增大(圖1 b)。小孢子母細胞完成正常的減數分裂，分裂完成時在4個核間產生細胞壁，并分隔成由胼胝質所包圍的4個細胞，形成正四面體形的小孢子四分體，4個小孢子處于共同的胼胝質中，通常只能觀察到3個小孢子(圖2 B)。

2.1.4 四分體至單核早期

花蕾明顯長大，萼片微高于花冠，花蕾呈淺綠色，蕾長約3.5—4.5 mm(圖1 C)。花藥基部獨立，上部結合，呈淺黃綠色，藥室內空間繼續增大(圖1 c)。這一階段小孢子已從四分體的胼胝質中釋放出來，此時小孢子具有不規則形狀(圖2 C)。

2.1.5 單核小孢子中后期

花蕾明顯長大，花冠接近萼片長度，花蕾呈淺綠色、淡黃，蕾長約4.5—6.5 mm(圖1 D)?；ㄋ幓拷Y合，形成花藥筒，呈黃綠色?；ǚ哿５娜龡l萌發溝清晰可見，細胞質中含有大液泡，細胞核靠邊，花粉粒形狀接近圓球形(圖2 D)。

2.1.6 雙核花粉粒形成期

花蕾充分膨大，花萼裂開，呈黃綠色，花冠微露于萼片外，黃色，絨毛稀疏，花蕾長約6.5—7.5 mm。各花藥聯合形成完整的花藥筒，呈淺黃色(圖1 E，e)?；ǚ哿＝涍^一次有絲分裂后形成雙核花粉粒，此時期可見一個染色較淡的營養細胞和一個染色較深的生殖細胞(圖2 E)。

2.1.7 成熟花粉粒時期

萼片、花瓣全部開裂，暴露出花藥，花冠深黃色，花朵長度約7.5—8.5 mm(圖1 F)。花藥黃色，花粉囊開裂，能夠散粉(圖1 f)?；ǚ哿０l育完成，形成顆粒飽滿充實、細胞質染色較深的成熟花粉粒(圖2 F)。

2.2 高溫脅迫對番茄小孢子發育影響的分析

2.2.1 花粉TTC染色結果

在正常溫度環境 (25℃/20℃)下，花藥內的成熟花粉粒數目多，花粉粒生活力強，花粉紅染率為84.65%。高溫脅迫環境(35℃/30℃)下，花藥內的成熟花粉粒數目減少，花粉生活力顯著減弱，紅染率為僅為10.72%(圖3)。

圖3 TTC染色法檢測Micro-Tom番茄成熟花粉粒在高溫脅迫前后的生活力變化Fig.3 Analysis of pollen viability of these plants subjected to normal(25℃/20℃)and high(35℃/30℃)temperature treatments by TTC staining

2.2.2 花粉萌發結果

對照花粉飽滿、顆粒之間無粘連(圖4 A，B);在25℃和35℃溫度下的萌發率分別為57.08%和52.62%，35℃下的萌發率略有降低，但差異不顯著。高溫脅迫花粉有空癟、外壁凹陷、顆粒粘連現象，正?；ǚ哿的勘壤^低(圖4 D);無論是在35℃還是在25℃的溫度下，均沒有發現處理后番茄的花粉管伸長，重復萌發實驗并將萌發時間延長至4 h仍然未觀察到花粉管伸長(圖4 C)。以上結果表明35℃/30℃高溫脅迫影響了小孢子發育，導致花粉敗育，而35℃高溫對正?；ǚ哿Ｃ劝l的影響不顯著。

圖4 適溫與高溫脅迫條件下發育的番茄‘Micro-Tom’成熟花粉粒體外萌發比較Fig.4 In vitro germination of tomato pollen grains under optimum(CK，25℃/20℃)or high temperature(HS，35℃/30℃)

2.2.3 石蠟切片結果

高溫脅迫處理材料與對照材料均能夠正常分化花藥壁的各層，藥室內的花粉小孢子母細胞排列整齊(圖5 A，G)。小孢子發育在四分體時期開始表現出差異。與對照相比，高溫脅迫處理材料的絨氈層細胞異常肥厚(圖5 H)。到了單核小孢子時期，對照材料的小孢子從胼胝質中釋放出來，形狀逐漸變圓，小孢子大小一致，細胞核接近小孢子中央，絨氈層開始降解并且貼近藥室內壁(圖5 C);此時期，高溫脅迫處理材料中只有一部分小孢子從四分體中釋放出來，大部分畸形并且聚集成團，絨氈層沒有降解反而明顯膨大、擠壓進入藥室內部(圖5 I)。單核小孢子中后期，對照材料的小孢子相互獨立分散于藥室內、染色加深，絨氈層降解留下絲線狀殘骸，藥室內壁細胞降解消退，花藥表皮細胞呈細長狀縱向排列，藥隔細胞減少，花藥同側兩藥室間膈膜變薄，裂口處的環狀細胞簇形成正常的圓環為花藥開裂做準備(圖5 D);高溫脅迫處理材料中，畸形小孢子則較多、大小不一致，絨氈層細胞體積增大、具有大液泡和較大細胞核，部分絨氈層細胞相互擠壓而破裂，花藥表皮細胞呈方形，裂口處的環狀細胞簇形成的圓環形狀不規則(圖5 J)。雙核花粉粒時期(開花前一天)，對照花粉粒充實，細胞質染色較深，僅有個別花粉粒畸形，絨氈層完全消失或僅存殘余，花藥同側的兩個藥室之間的藥隔解體，兩個藥室相互連通成為一體，裂口附近花藥壁僅剩一層表皮細胞且排列整齊，花藥開裂(圖5 E);高溫脅迫處理材料花藥中的正?；ǚ哿O少，多數花粉?；位蛲Ｖ拱l育，而且花粉粒被絨氈層細胞包圍而積聚粘連，花藥開裂但裂口不規則，裂口附近花藥壁細胞畸形(圖5 K)?；ǘ溟_放時，對照材料藥室完全打開，都能散粉，花藥維管等組織仍保持原有結構(圖5 F);然而，高溫脅迫材料的藥室塌陷，花藥表現出萎縮狀(圖5 L)。

對番茄小孢子發育過程的連續觀察研究，表明35℃熱脅迫處理影響了小孢子、絨氈層、藥隔、花藥壁等的正常發育，從而導致花粉粒畸形或敗育，產生的正?；ǚ哿盗繃乐販p少，花藥散粉障礙等，進而影響花朵的正常授粉受精過程。

3 討論

番茄品種‘Micro-Tom’由于其生長周期短，易于栽培等特性，已經成為番茄遺傳與發育研究的重要模式品種。本研究通過對番茄‘Micro-Tom’小孢子細胞核形態學以及DAPI染色觀察，依據核發育變化，將小孢子發育過程分為孢母細胞時期、四分體小孢子時期、單核小孢子早期、單核小孢子中后期、雙核花粉粒時期和成熟花粉粒時期等6個主要時期，這與Brukhin［16］、辛建華［17］等對番茄小孢子發育主要時期的劃分基本一致。依據番茄‘Micro-Tom’小孢子發育時期與花蕾外部形態、花蕾長度和花藥發育特征的對應關系，劃分出的小孢子發育時期依次對應于 Brukhin［16］劃分的花發育階段的 stage7-8、stage9-11、stage12-13、stage14-15、stage16-17 和stage18-20。因此，依據花蕾形態觀察能夠判斷‘Micro-Tom’番茄小孢子發育時期，為后續番茄生殖發育分子生物學研究提供取材依據。但由于花蕾的大小會因環境的變化而存在差異［17］，實驗中應注意環境條件的控制，在精細實驗中有必要借助于小孢子的鏡檢觀察來準確無誤地確定發育時期。

圖5 番茄‘Micro-Tom’各級花蕾的石蠟切片觀察Fig.5 Investigation of tomato microspores development stages using paraffin section

可育番茄小孢子在正常發育情況下，絨氈層在單核小孢子發育早期啟動PCD(Programmed Cell Death)進程，不斷自我降解而提供營養給小孢子發育。本研究發現，高溫脅迫(35℃/30℃)后，花藥絨氈層內絨氈層細胞液泡化膨大、裂口附近細胞延遲降解，而番茄小孢子畸形或敗育、空癟凹陷花粉粒數量比例大等現象。絨氈層發育異?，F象在番茄雄性不育材料中的研究較多。本研究表明，熱脅迫處理番茄的小孢子敗育從四分體小孢子時期到花粉成熟時期均有發育異常表現，這一結果與毛秀杰［20］、袁亦楠［21］等研究的番茄雄性不育系小孢子發育異常發生在廣泛時期內的結果基本一致。本研究結果表明，熱脅迫處理造成花粉畸形或敗育與絨氈層細胞的發育紊亂密切相關。絨氈層細胞降解延遲，未提供充足的營養物質供小孢子發育和花粉壁結構的形成，類似現象在水稻［22］、擬南芥［23-24］等作物研究中也有報道。同時，絨氈層細胞高度液泡化并向藥室內生長使藥室內空間變小;花朵開放花藥開裂時，破碎的絨氈層細胞及其內含物使花粉粒粘連成團，該現象在本研究花粉萌發實驗中同樣可被觀察到，表明高溫脅迫不僅使花粉畸形或敗育，而且使花藥散粉困難。

本研究還發現，熱脅迫還引起了藥隔組織、藥室內壁、花藥表皮、環狀細胞簇等花藥細胞結構的發育異常。張桂蓮等［25］對水稻的研究發現，水稻耐熱品系在高溫脅迫下花藥維管組織正常，而熱敏感品系在高溫脅迫下花藥維管組織發育異常。高溫脅迫使番茄植株韌皮部形成胼胝質，胼胝質因阻塞胞間連絲而增加韌皮部的阻力［11］，而高溫對番茄花藥維管組織發育是否有類似影響尚需研究考證。有關熱脅迫引起的番茄小孢子和花藥組織發育異常的分子生物學研究在本實驗室還在進行中，希望有助于闡明熱脅迫對番茄小孢子發育的影響機制，并為培育耐高溫農作物新品種提供新途徑。

［1］Peet M M，Bartholemew M.Effect of night temperature on pollen characteristics，growth and fruit set in tomato(Lycopersicon esculentum Mill.).Journal of the American Society for Horticulture Science，1996，121(3):514-519.

［2］Erickson A N，Markhart A H.Flower developmental stage and organ sensitivity of bell pepper(Capsicum annuum L.)to elevated temperature.Plant，Cell and Environment，2002，25(1):123-130.

［3］Suzuki K，Takeda H，Tsukaguchi T，Egawa Y.Ultrastructural study on degeneration of tapetum in anther of snap bean(Phaseolus vulgaris L.)under heat stress.Sexual Plant Reproduction，2001，13(6):293-299.

［4］Zinn K E，Tunc-Ozdemir M，Harper J F.Temperature stress and plant sexual reproduction:uncovering the weakest links.Journal of Experimental Botany，2010，61(7):1959-1968.

［5］Zhang G L，Chen L Y，Lei D Y，Zhang S T.Progresses in research on heat tolerance in rice.Hybrid Rice，2005，20(1):1-5.

［6］Sakata T，Takahashi H，Nishiyama I，Higashitani A.Effects of high temperature on the development of pollen mother cells and microspores in Barley Hordeum vulgare L.Journal Plant Research，2000，113(4):395-402.

［7］Wahid A，Gelani S，Ashraf M，Foolad M R.Heat tolerance in plants:an overview.Environmental and Experimental Botany，2007，61(3):199-233.

［8］Lu M H，Gong Z H，Chen R G，Huang W，Li D W.High temperature stress on crop pollen:a review.Chinese Journal of Applied Ecology，2009，20(6):1511-1516.

［9］Peet M M，Willits D H，Gardner R.Response of ovule development and post-pollen production processes in male-sterile tomatoes to chronic，subacute high temperature stress.Journal of Experimental Botany，1997，48(1):101-111.

［10］Peet M M，Sato S，Gardner R G.Comparing heat stress effects on male-fertile and male-sterile tomatoes.Plant，Cell and Environment，1998，21(2):225-231.

［11］An F X，Li J F，Xu X Y.Study on present condition of heat tolerance of tomato.Journal of Northeast Agricultural University，2005，36(4):507-511.

［12］Du Y C，Mao S L，Wang X X，Zhu D W，Li S D，Dai S S，Gao Z H.The different changes of endogenous polyamines in tomato plants with different heat-tolerance under high temperatures.Acta Horticulturae Sinica，2003，30(3):281-286.

［13］Alsadon A A，Wahb-allah M A，Khalil S O.In vitro evaluation of heat stress tolerance in some tomato cultivars.Agricultural Sciences，2006，19(1):13-24.

［14］Frank G，Pressman E，Ophir R，Althan L，Shaked R，Freedman M，Shen S，Firon N.Transcriptional profiling of maturing tomato(Solanum lycopersicum L.)microspores reveals the involvement of heat shock proteins，ROS scavengers，hormones，and sugars in the heat stress response.Journal of Experimental Botany，2009，60(13):3891-3908.

［15］Chen G J，Cheng Y J，Wu D H，Wu X Y.Microsporogenesis，megasporogenesis and male，female gametophyte development in tomato(Lycopersion esculentum).Journal of South China Agricultural University，1999，20(2):36-40.

［16］Brukhin V，Hernould M，Gonzalez N，Chevalier C，Mouras A.Flower development schedule in tomato Lycopersicon esculentum cv.sweet cherry.Sexual Plant Reproduction，2003，15(6):311-320.

［17］Xin J H，Zhang Y H，Yuan Y W.Study on interrelation of cytological development period of processing tomato microspor and morphology of flower organ.Northern Horticulture，2007，(5):15-17.

［18］Shen J，Cao G Q，Liang Q X，Ying F Q，Ding X B.Identification of cytological development period and activity of tomato's microspore.Journal of Changjiang Vegetables，2008，(16):21-24.

［19］Karapanos I C，Akoumianakis K A，Olympios C M，Passam H C.Tomato pollen respiration in relation to in vitro germination and pollen tube growth under favourable and stress-inducing temperatures.Sexual Plant Reproduction，2010，23(3):219-224.

［20］Mao X J，Liu T，Sun Z F，Yan J G.Cytological observasion on microsporogenesis of the male sterile of tomato.Seed，2009，25(8):1-3.

［21］Yuan Y N，Zhu D W，Lian Y，Dai S S，Lu C X.Cytological investigations on microspore development in the male sterile L.esculentum vat.95305.Acta Agriculturae Boreall-Sinica，2000，15(3):61-65.

［22］Li N，Zhang D S，Liu H S，Yin C S，Li X X，Liang W Q，Yuan Z，Xu B，Chu H W，Wang J，Wen T Q，Huang H，Luo D，Ma H，Zhang D B.The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetum degradation and anther development.The Plant Cell，2006，18(11):2999-3014.

［23］Vizcay-Barrena G，Wilson Z A.Altered tapetal PCD and pollen wall development in the Arabidopsis ms1 mutant.Journal of Experimental Botany，2006，57(11):2709-2717.

［24］Xu J，Yang C Y，Yuan Z，Zhang D S，Gondwe M Y，Ding Z W，Liang W Q，Zhang D B，Wilson Z A.The ABORTED MICROSPORES regulatory network is required for postmeiotic male reproductive development in Arabidopsis thaliana.The Plant Cell，2010，22(1):91-107.

［25］Zhang G L，Chen L Y，Zhang S T，Liu G H，Tang W B，Li M H，Lei D Y，Chen X B.Effects of high temperature stress on pollen characters and anther microstructure of rice.Acta Ecologica Sinica，2008，28(3):1089-1097.

參考文獻:

［5］張桂蓮，陳立云，雷東陽，張順堂.水稻耐熱性研究進展.雜交水稻，2005，20(1):1-5.

［8］逯明輝，鞏振輝，陳儒鋼，黃煒，李大偉.農作物花粉高溫脅迫研究進展.應用生態學報，2009，20(6):1511-1516.

［11］安鳳霞，李景富，許向陽.番茄耐熱性研究現狀.東北農業大學學報，2005，36(4):507-511.

［12］杜永臣，毛勝利，王孝宣，朱德蔚，李樹德，戴善書，高振華.高溫脅迫下耐熱性不同番茄多胺水平變化的差異.園藝學報，2003，30(3):281-286.

［15］陳國菊，程玉瑾，吳定華，吳筱穎.番茄大、小孢子的發生及雌、雄配子體的發育.華南農業大學學報，1999，20(2):36-40.

［17］辛建華，張永華，苑育文.加工番茄小孢子發育時期與花器形態相關性研究.北方園藝，2007，(5):15-17.

［18］申娟，曹剛強，梁秋霞，應芳卿，丁曉兵.番茄小孢子發育時期的檢測和活性鑒定.長江蔬菜，2008，(16):21-24.

［20］毛秀杰，劉婷，孫中峰，閆建國.番茄雄性不育系JL-2小孢子發育的細胞學觀察.種子，2009，25(8):1-3.

［21］袁亦楠，朱德蔚，連勇，戴善書，陸長旬.番茄雄性不育突變體小孢子發育的細胞學研究.華北農學報，2000，15(3):61-65.

［25］張桂蓮，陳立云，張順堂，劉國華，唐文邦，李梅華，雷東陽，陳信波.高溫脅迫對水稻花粉粒性狀及花藥顯微結構的影響.生態學報，2008，28(3):1089-1097.