響應面分析法對α-淀粉酶抑制劑篩選方法的優(yōu)化

許云青，龍盛京

（廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西南寧530021）

隨著世界人口老齡化，糖尿病已經(jīng)成為一種嚴重影響健康的常見病、多發(fā)病，是繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三位殺手。在我國，糖尿病發(fā)病率近10年逐年上升，平均每年增加100多萬，其中Ⅱ型糖尿病占到90%以上，Ⅰ型糖尿病不到10%[1]。在Ⅱ型糖尿病的治療中α-淀粉酶抑制劑發(fā)揮著重要的作用。α-淀粉酶抑制劑能抑制腸道內唾液、胰淀粉酶的活性，阻礙或延緩人體對食物中主要碳水化合物的水解和消化，降低食物淀粉糖類物質的分解吸收，降低血糖，抑制血糖濃度的升高，從而有利于糖尿病患者的飲食治療。對于肥胖患者，可減少糖向脂肪轉化，延緩腸道排空，增加脂肪消耗以減輕體重[2]。國外已經(jīng)把α-淀粉酶抑制劑應用在減肥和保健食品上[3]。因此篩選和尋找安全、有效的α-淀粉酶抑制劑仍是藥物學家們關注的熱點之一。

目前在α-淀粉酶抑制劑的體外篩選實驗中，α-淀粉酶的主要來源多為胰α-淀粉酶，胰α-淀粉有著來源不易、成本高等缺點。α-淀粉酶抑制劑測定方法多采用3，5-二硝基水楊酸法，其測定原理：α-淀粉酶抑制劑特異性地抑制α-淀粉酶，減少α-淀粉酶對淀粉水解，使得淀粉降解產(chǎn)物減少，3，5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原的棕紅色氨基化合物減少，在一定波長下吸光度值降低。通過對添加抑制劑前后生產(chǎn)還原糖的量進行定量測定，可從前后變化測得α-淀粉酶抑制劑的活性[4]。在Bemfeld法[5]測定α-淀粉酶活性中，要求調整抑制劑及α-淀粉酶液濃度使得A值在0.4～0.7之間，范圍較窄，不利于比較不同抑制劑活性及量效關系。本實驗以工業(yè)α-淀粉酶代替胰α-淀粉酶，運用響應面分析法對原有的Bemfeld法進行優(yōu)化設計，優(yōu)化后的方法穩(wěn)定可靠、實用，可運用于α-淀粉酶抑制劑的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-淀粉酶 天津福辰試劑廠，批號：20120502，酶活力單位1000～2000U/mg；可溶性淀粉 天津市大茂化學試劑廠；阿卡波糖 規(guī)格：每片50mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：H19990205；3，5-二硝基水楊酸 成都科龍化學試劑廠，批號：20120701；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、丙三醇 均為國產(chǎn)分析純；藥材水提物 待測樣品，筆者自提；α-淀粉酶液 用0.2mol·L-1磷酸緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用；可溶性淀粉液 用0.2mol·L-1磷酸緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用；3，5-二硝基水楊酸試液 取3，5-二硝基水楊酸6.5g，加入325mL的2mol·L-1氫氧化鈉和45mL丙三醇，加蒸餾水至1000mL，溶解，室溫存放備用。

紫外可見分光光度計、扭力托盤天平 上海精密科學儀器有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；漩渦混合器 江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；不銹鋼電熱恒溫水浴 北京市醫(yī)療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 a-淀粉酶活性測定體系的測定方法 α-淀粉酶活性的測定采用Benfield法[5]：總反應體系為1mL[6]。取0.2mL α-淀粉酶于試管中，加入0.4mL可溶性淀粉液，加入0.4mL磷酸緩沖液（測定抑制率時為0.2mL樣品液+0.2mL磷酸緩沖液），充分混勻，置于50℃水浴中孵化30min后，加入6.5g·L-1的3，5-二硝基水楊酸顯色劑3.0mL，混勻，于沸水浴中反應10min，室溫冷卻，取其反應液0.5mL，加入蒸餾水4.5mL，混勻。在紫外可見分光光度計520nm波長下測定吸光度值。酶的抑制率按下式計算：

1.2.2 影響α-淀粉酶活性的單因素考察 α-淀粉酶的活性測定的影響因素主要為pH、底物濃度、酶濃度、酶與底物濃度的比例、溫度、金屬離子等，影響酶活性的金屬離子較多，本文在此不做研究，主要對pH、底物濃度、酶濃度、酶與底物濃度比例、溫度進行探討。本次實驗所用α-淀粉酶的最適溫度為50～70℃，因此在最終確定孵化溫度之前所用的孵化溫度均為50℃。

1.2.2.1 緩沖體系pH的確定 配制pH范圍為5.8～7.6的磷酸鹽緩沖體系，10g·L-1的α-淀粉酶液及2%可溶性淀粉液用蒸餾水配制。按1.2.1α-淀粉酶活性的測定方法，測定α-淀粉酶在此pH范圍的活性變化。

1.2.2.2 α-淀粉酶濃度的選擇 用1.2.2.1中確定的0.2mol·L-1pH6.6的磷酸緩沖液配制濃度為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g·L-1的α-淀粉酶溶液，然后各取0.2mL，再用0.2mol·L-1pH6.6磷酸緩沖液補充至1mL，混勻。按1.2.1方法，測定A520nm的值，繪制曲線。

1.2.2.3 可溶性淀粉濃度的選擇 用0.2mol·L-1pH6.6的磷酸緩沖液配制含0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、15.0、16.0、18.0、20.0g·L-1的可溶性淀粉液，然后各取0.4mL，再用0.2mol·L-1pH6.6磷酸緩沖液補充至1mL，混勻。按1.2.1方法測定A520nm，繪制曲線。

1.2.2.4 體系中α-淀粉酶與可溶性淀粉比例的確定在1.2.2.2中確定1mL反應體系中α-淀粉酶的終濃度為10g·L-1后，按照1.2.1的操作方法考察不同濃度淀粉液對酶活性測定中A值范圍的影響。

(1)加強對品管圈護理人員與患者的教育與知識宣傳,向患者講解內瘺穿刺的原理方法以及在穿刺時對患者的要求,并鼓勵家屬共同參與,提高護理人員及患者對內瘺穿刺點滲血的認識,以達到減少并盡量避免動靜脈內瘺穿刺點滲血的效果。

1.2.2.5 孵化溫度的確定 用0.2mol·L-1pH6.6的磷酸緩沖液配制濃度為10g·L-1α-淀粉酶液及2%可溶性淀粉液。按照1.2實驗操作方法測定不同孵化溫度對酶活性的影響。

1.2.3 采用響應面法優(yōu)化α-淀粉酶活性的測定 根據(jù)Box-Benheken中心組合實驗原理，綜合各單因素對α-淀粉酶活性影響的大小，最終選擇酶-淀粉比例、緩沖pH、孵化溫度

3個因素，以測定的吸光度值為響應值，在單因素實驗的基礎上，最終確定A（酶-淀粉比例）、B（緩沖pH）、C（孵化溫度）的水平值，響應面分析的因素與水平表見表1。

表1 響應面分析的因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface method

1.2.4 中藥水提物對α-淀粉酶活性影響 取中藥材粉末10.00g，加入100mL蒸餾水，95℃水浴提取30min，過濾，殘渣加入80mL蒸餾水，95℃水浴提取30min，過濾，殘渣加入60mL蒸餾水，95℃水浴提取30min，過濾，合并三次濾液，定容至250mL，取實驗用量離心，作為待測液。在選定最佳條件下，按照1.2.1實驗方法，在1mL反應體系中測定待測液對α-淀粉酶的抑制作用。

2 結果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 磷酸緩沖體系pH的確定 體系的pH對酶活力影響較大，通常在最佳pH下，酶相對比較穩(wěn)定，在此條件下反應能最大程度發(fā)揮酶的活力，提高酶反應效力。從圖1的結果得出，pH在6.2～6.6區(qū)段α-淀粉酶活性基本保持不變，pH6.8后，隨pH增大，酶活性減小。所以選取pH為6.6左右。

圖1 α-淀粉酶活性與pH的關系Fig.1 The relationship between α-amylase and pH

2.1.2 α-淀粉酶濃度的選擇 1mL反應體系中，加入濃度為0.1～10g·L-1α-淀粉酶，結果表明，不同濃度的α-淀粉酶對反應體系的影響不大，吸光度值在0.055～0.06微小范圍內變化。本實驗所用的α-淀粉酶活單位為1000～2000U/mg，活性較低，為保證整個反應系統(tǒng)的完全反應，本實驗選擇α-淀粉酶的濃度為10g·L-1。

圖2 不同濃度α-淀粉酶對系統(tǒng)本底A值的影響Fig.2 Effect of different α-amylase content on A520nm

2.1.3 可溶性淀粉濃度的選擇 1mL反應體系中，加入可溶性淀粉濃度為0.1～20.0g·L-1，結果表明淀粉濃度對系統(tǒng)A值影響較大，隨淀粉濃度增大吸光度值增大。

圖3 不同濃度淀粉對系統(tǒng)本底A值影響Fig.3 Effect of different starch content on the absorbance at 520nm

2.1.4 體系中α-淀粉酶與可溶性淀粉比例的考察 在無α-淀粉酶抑制劑存在時，系統(tǒng)反應A值在0.8～1.4范圍有利于抑制劑活性強弱的比較。所以本實驗選擇A值在1.2左右時的淀粉濃度（15g·L-1）。在1mL反應體系中確定α-淀粉酶和可溶性淀粉的濃度比為1∶1.5左右。

圖4 酶-淀粉液不同比例對反應體系A值影響Fig.4 Effect of different the proportion of the enzyme starch solution on the absorbance at 520nm

2.1.5 孵化溫度對α-淀粉酶活性的影響 酶的活性受溫度影響較大，實驗結果顯示孵化溫度為55～60℃時，溫度對酶活性的影響基本保持不變，溫度大于60℃后，隨溫度增加體系A值減小。溫度太低或太高，均對α-淀粉酶活性不利，本實驗選取中間溫度即55℃左右。

圖5 不同孵化溫度下反應體系A520nmFig.5 Effect of different temperature on A520nm

2.2 響應面分析結果

2.2.1 響應面設計方案 響應面實驗設計結果及分析見表2。

表2 響應面分析實驗結果Table 2 Results of response surface central composite design

2.2.2 回歸方程和方程分析 Box-Behnken實驗擬合出的回歸方程為：

Y=-5.2286+0.2468A+0.017B+0.013C+0.02AB-0.018AC+0.0045BC+0.053A2-0.095B2-0.023C2

回歸方程各項的方差分析見表3。

由表3可知，用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（r=模型平方和/總離差平方和[7]，即r=0.9904），模型的顯著水平小于0.0001，說明此模型是高度顯著的，該實驗方法是可靠的。從回歸方程各項的方差分析可以看出，方差的失擬項較小，而且不顯著，表明該方程對實驗結果擬合良好，實驗結果誤差小，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。從顯著性可以看出，α-淀粉酶與可溶性淀粉比例對α-淀粉酶活性的影響最為顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of terms of regression equation

2.2.3 響應面圖分析 RSM方法圖形是特定的響應面Y值對應的因素A、B、C構成的一個三維空間在二維平面上的等溫圖，可以直觀地反應各因素對響應面值的影響，從實驗所得的響應面分析圖上可以找到其在反應過程中的相互作用[8]。回歸響應面曲線見圖6。

圖6直觀反映了各因素對響應值的影響，比較可知：酶-淀粉比例對α-淀粉酶的活性影響大，表現(xiàn)為曲線較陡。各因素的交互作用不顯著。

預測最優(yōu)條件：pH6.54、孵化溫度55.94℃、酶-淀粉比例1∶2，吸光度值達1.69，考慮到操作便利，α-淀粉酶活性測定選取pH6.6，孵化溫度55℃，酶-淀粉比例1∶2。按照此條件平行三次驗證實驗，得到平均吸光度值為1.63，與預測值（1.69）基本相符合。酶-淀粉比值為1∶2時，吸光度值大于1.4，不利于抑制活性強弱比較，所以選擇次優(yōu)值，控制吸光度值在1.2左右。由于酶-淀粉比例對α-淀粉酶活性影響最大，最終選取酶-淀粉比例為1∶1.5，此時的預測值為1.259。選定pH6.6、孵化溫度55℃、酶-淀粉比例1∶1.5測定吸光度值，平行三次實驗，平均結果為1.222，與預測值（1.259）基本相符。且此吸光度值利于在比色測定時抑制劑對α-淀粉酶抑制作用的分辨。最終選擇條件磷酸緩沖液pH6.6、孵化溫度55℃、酶-淀粉比例1∶1.5。

2.2.4 中藥材水提物對α-淀粉酶活性影響 結果見表4。實驗表明黃芪對α-淀粉酶有明顯抑制作用，牛蒡子、桑寄生、玄參、烏梅、雞血藤對α-淀粉酶無明顯抑制作用。6種藥材對α-淀粉酶抑制作用均小于阿卡波糖。

圖6 回歸優(yōu)化響應面曲線圖Fig.6 Optimization of response surface by regression

表4 中藥水提液對α-淀粉酶活性的影響Table 4 Effect of water-extract from traditional Chinese medicine onα-amylase activity

3 結論

本實驗對Bemfeld法中pH、孵化溫度、α-淀粉酶濃度、可溶性淀粉濃度及α-淀粉酶與可溶性淀粉比例進行一系列考察，并運用響應面分析法進行優(yōu)化組合，最終確定反應體系的最佳條件為：pH6.6、孵化溫度55℃、α-淀粉酶-可溶性淀粉比例1∶1.5。

原測定法中要求A值測試區(qū)間設在0.4～0.7之間，范圍較窄，不利于比較不同抑制劑活性劑量效關系。目前國內常見的可見分光光度計多采用每毫米1200條衍射光柵，光度范圍達到2.5A，光度值也提高到0.5%T，因此在0.2～1.5范圍內測定A值，誤差影響不大[6]。本實驗運用響應面分析法，結合使用可見分光光度計，優(yōu)化模型測定體系，提高了A值的測定范圍，更有利于比較α-淀粉酶抑制劑活性強弱的研究。優(yōu)化后的α-淀粉酶抑制劑測定方法適用范圍廣，通過重復實驗證明此模型穩(wěn)定、通過中藥水提液及陽性對照物阿卡波糖對α-淀粉酶抑制作用實驗證明此模型可行。表明本實驗優(yōu)化后的測定方法可運用于α-淀粉酶抑制劑的篩選。

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