過氧乙酸氧化大豆蛋白工藝參數優化

王 朗，李軍生，閻柳娟，黃國霞

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

大豆蛋白營養豐富，氨基酸種類齊全，常被作為食品中蛋白質的補充物，因此在食品領域有著廣泛的應用。另外有報道稱大豆蛋白可以作為一種新型原料應用于化工行業[1]。但是，在日常生活中，由于天然大豆蛋白基本沒有表面活性，很難滿足人們對不同蛋白質加工性質的需求。因此，通過改性進而拓寬大豆蛋白的應用范圍是人們迫切的愿望。大豆蛋白主要由β-大豆伴球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成，兩者都是大豆主要的儲存蛋白[2]。7S球蛋白和11S球蛋白都含有較多的二硫鍵，二硫鍵對于穩定蛋白質空間結構具有重要作用[3-4]。蛋白質在二硫鍵與其他一些化學鍵的作用下，分子內部容易形成緊密折疊的空間結構。因此，通過改變分子內部的價鍵結構從而改變蛋白質的功能性質，是一種很好的方法。如酸性水解蛋白質，使之多肽鏈展開，進而改變其表面活性；氧化還原內部二硫鍵，使被埋藏的基團暴露，進而改變其表面活性。如李軍生等[5]利用氧化劑打開二硫鍵制得了很好的表面活性劑；袁道強等[6]對大豆分離蛋白進行超聲處理提高了其溶解性；Karina等[7]通過對大豆蛋白進行水解發現，2%的水解度可提高大豆蛋白的表面活性。乙酸是國標規定的食品添加劑，作為酸度調節劑有著廣泛的用途，本實驗希望利用過氧乙酸打開二硫鍵，使過氧乙酸轉化為乙酸，從而制備無毒的蛋白質表面活性劑，并比較二硫鍵斷裂前后大豆蛋白功能特性的變化，為進一步改性大豆蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PHS-25CVV型精密pH計 上海理達儀器廠；LD4-2型低速離心機 北京醫用離心機廠；VFD-2000冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器公司；UV-2012PC型紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Mikro-200臺式離心機 球興科儀國際貿易有限公司；VEGA3 EasyProbe掃描電子顯微鏡 捷克TESCAN公司；100LX型高剪切混合乳化頭 上海威宇機電制造有限公司；DT-102型全自動界面張力儀 淄博華坤電子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氧化大豆蛋白的制備 稱取一定量大豆蛋白粉，按蛋白粉與水1∶10比例將其配制成乳液，置于三口燒瓶中，25℃下攪拌1h后離心，離心速度為4000r/min，15min后提取上清液。取一定量的上清液進行氧化處理，處理完的溶液用酸堿調節至等電點（pH=4.5），在4000r/min離心15min，水洗沉淀多次后，冷凍干燥，得到氧化大豆蛋白。反應原理圖見圖1。

圖1 反應原理圖Fig.1 Reaction schematic

1.2.2 可溶性大豆蛋白巰基及二硫鍵含量的測定 采用Ellman[8]方法并做適宜的調整，即用Ellman試劑對游離巰基進行顯色反應，然后在波長412nm處測定吸光度A412，按下式計算游離巰基和總巰基[9]。

SH（μmol/g）=（73.53×A412×D）/C

式中：A412表示蛋白質的吸光度；D為稀釋倍數，對于游離SH，D=15.1，對于總SH，D=76.25；C為蛋白固形物含量（mg/mL）。

測定二硫鍵含量的原理是先用巰基乙醇還原二硫鍵為SH，測定總SH含量，然后換算出二硫鍵（SS）的含量。公式如下：SS（μmol/g）=（總SH-游離SH）/2

馬錢子堿及其納米結構脂質載體在大鼠體內的藥動學比較研究 …………………………………………… 管慶霞等（20）：2777

二硫鍵打開率（%）=（大豆蛋白二硫鍵含量-氧化大豆蛋白二硫鍵含量）/大豆蛋白二硫鍵含量

1.2.3 大豆蛋白氧化工藝參數優化實驗 采用單因素實驗，分別研究氧化劑用量、反應溫度、反應時間對二硫鍵含量的影響。每次處理重復三次，每次做三個平行。

1.2.3.1 20%過氧乙酸用量對二硫鍵含量的影響 取50mL大豆蛋白上清液，置于錐形瓶中，20%過氧乙酸加入量分別加入4%、8%、12%、16%、20%，搖勻；-10℃靜置3h，測定二硫鍵含量。

1.2.3.2 反應溫度對二硫鍵含量的影響 取50mL大豆蛋白上清液，置于錐形瓶中，氧化劑用量16%，反應時間3h，反應溫度-20、-10、0、10、20℃，測定二硫鍵含量。

1.2.3.3 反應時間對二硫鍵含量的影響 取50mL大豆蛋白上清液，置于錐形瓶中，過氧乙酸用量16%，反應溫度-10℃，反應時間1、2、3、4、5h，測定二硫鍵含量。

表1 正交實驗因素與水平設計表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 過氧乙酸用量對巰基、游離巰基含量的影響Table 2 Effect of amount of CH3COOOH on the content of sulfhydryls and free sulfhydryls

根據以上因素進行正交實驗因素水平設計，見表1。

1.2.4 乳化性的測定 參照Pearce[10]法進行測定。

1.2.5 起泡性的測定 參照李維瑤等的方法[11]進行測定。

1.2.6 HLB值的測定 采用乳化法[12]進行測定。

1.2.7 CMC值的測定 采用張佳程等[13]的表面張力法進行測定。

1.2.8 表面張力的測定 采用表面張力儀進行測定。

1.2.9 數據處理 采用SPSS 20.0.0進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 過氧乙酸對巰基、游離巰基含量的影響

過氧乙酸對巰基、游離巰基含量的影響如表2所示。反應條件：反應溫度-10℃，反應時間4h。

由表2可知，樣品蛋白的二硫鍵含量為8.11μmol/g，游離巰基和總巰基的含量都隨著氧化劑用量的增大而減小，其中，游離巰基的變化較為明顯，當氧化劑用量為2.50mL的時候，游離巰基被全部氧化，總巰基的含量則一直呈現減小的趨勢。

2.2 過氧乙酸用量對二硫鍵含量的影響

過氧乙酸用量是影響二硫鍵含量的重要因素，過氧乙酸是打開二硫鍵反應物之一，化學反應動力學理論表明：增加反應物有助于反應向正方向移動。為研究氧化物用量的影響，結果如圖2所示。

圖2 過氧乙酸用量對二硫鍵含量的影響Fig.2 Effect of amount of CH3COOOH on the content of the disulfide bond

由圖2可知，隨著過氧乙酸用量的增加，大豆蛋白的二硫鍵含量呈減小趨勢。這是由于大豆蛋白中的游離SH被氧化為磺酸基，隨著過氧乙酸用量的增加，過氧乙酸除了氧化游離SH成為磺酸基還會進一步氧化二硫鍵成為磺酸基。實驗表明，當過氧乙酸用量大于20%時，經氧化改性的大豆蛋白在等電點處離心無法得到沉淀，而是呈現出懸浮狀，這可能是由于過度氧化使得大豆蛋白嚴重變性。因此過氧乙酸用量選16%。

2.3 反應溫度對二硫鍵含量的影響

反應溫度對二硫鍵含量的影響如圖3所示。

圖3 反應溫度對二硫鍵含量的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the content of the disulfide bond

從圖3可以看出，二硫鍵含量隨著反應溫度增加而增加，二硫鍵含量在-10～10℃變化明顯，這可能是由于蛋白質內部結構的改變與溫度的變化有關或者與反應為放熱有關。從實際生產情況考慮，溫度不宜低于0℃，因此選取反應溫度0℃。

2.4 反應時間對二硫鍵含量的影響

反應時間對二硫鍵含量的影響如圖4所示。

圖4 反應時間對二硫鍵含量的影響Fig.4 Effect of reaction time on the content of the disulfide bond

由圖4可以看出，二硫鍵的含量隨著反應時間的增加而降低。當反應時間4h時，大豆蛋白二硫鍵含量基本不變。因此，適宜的反應時間4h。

2.5 大豆蛋白氧化正交實驗

為了確定二硫鍵打開的最佳條件，在單因素的基礎上，選取對反應影響最為顯著的因素：氧化劑用量、反應溫度、反應時間制定L9（34）正交表進行正交分析。大豆蛋白氧化正交實驗設計及結果如表3所示。

由表3極差值R可以看出，各因素對大豆蛋白二硫鍵含量的影響程度主次順序依次為：過氧乙酸用量、反應溫度、反應時間，最佳反應條件為A3B1C3，即氧化劑20%，反應溫度-10℃，反應時間4h，在此條件下二硫鍵含量2.91μmol/g，其打開率68.53%。方差分析結果表明，過氧乙酸用量和溫度對二硫鍵含量的影響極顯著（p＜0.01），反應時間影響顯著（p＜0.05）。

表3 正交實驗設計與結果Table 3 The orthogonal experimental design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of Variance

2.6 氧化大豆蛋白表面活性

氧化大豆蛋白表面活性如表5所示。

由表5可以看出，改性后的大豆蛋白表面活性得到了提高，其中起泡性提高了60.57%，乳化性提高了11.45%，HLB值、起泡穩定性和乳化穩定性均有所提高，表面張力、CMC值減小。

2.7 氧化對大豆蛋白結構的影響

大豆蛋白、氧化大豆蛋白的掃描電鏡照片如圖5所示。

大豆蛋白經過氧化處理后，進行SEM掃描。結果顯示：未改性的大豆蛋白呈球狀。這是因為大豆蛋白的主要成分為大豆球蛋白和β-大豆伴球蛋白。改性后的大豆蛋白結構不同于未改性大豆蛋白，其內部出現較大的縫隙，這些縫隙可能是由于二硫鍵斷裂后，蛋白質內部分子間的相對運動不再受二硫鍵的限制，出現偏離而產生的結果。縫隙的出現使水分子較容易的通過，進而有助于氧化大豆蛋白的提取。

表5 氧化大豆蛋白表面活性Table 5 Surface activity of oxidized soy protein

圖5 大豆蛋白、氧化大豆蛋白的掃描電鏡照片（5000×）Fig.5 The SEM picture of soy protein and oxidized soy protein（5000×）

3 結論

采用過氧乙酸氧化大豆蛋白制備表面活性劑，較其他化學方法具有無毒、易降解等特點，產品可直接應用于食品領域。通過正交實驗確定了二硫鍵氧化工藝的最佳條件：20%的過氧乙酸用量20%，反應溫度-10℃，反應時間4h，在此條件下，二硫鍵的打開率為68.53%。

掃描電鏡顯示，氧化改性后的大豆蛋白內部出現更多的縫隙，說明大豆蛋白在氧化過程中結構發生了改變。

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