油松花粉蛋白提取工藝的優(yōu)化

范三紅，王相帥，王亞云，胡雅喃，劉曉華

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

松花粉，為鮮黃色或淡黃色細(xì)粉，其性味甘平無毒，顯微鏡下呈橢圓形或類球形，輪廓線明顯，表面有類圓形或多角形紋理或小顆粒狀突起，兩側(cè)各有一膨大的半圓形或近圓形氣囊，氣囊壁有明顯大小不一的網(wǎng)狀紋理，網(wǎng)眼呈多角形或類圓形[1]。松花粉藥名松花、松黃，始載于唐《新修本草》，松花粉是我國特有的鄉(xiāng)土樹種——馬尾松和油松的花粉[2]。花粉中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類等多種營養(yǎng)成分以及酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等生物活性物質(zhì)，因此有“微型營養(yǎng)庫”之美譽(yù)[3]。人服用后能在很短的時(shí)間內(nèi)被人體快速吸收，促進(jìn)人體正常新陳代謝，提高肌體免疫能力，對人類有很好的保健價(jià)值[4]。松花粉有這延緩衰老、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、降血脂等多種特殊功能，是一種天然的具有保健功能性的食品材料[5-7]。

油松花粉中含有的蛋白質(zhì)，對人體的健康保健起著很大的作用。從油松花粉中分離出的蛋白質(zhì)，可以用來研究其蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，用以研究出新的蛋白功能性食品。不僅如此，根據(jù)測定蛋白質(zhì)的含量和對蛋白質(zhì)的最佳提取工藝研究，可以研究出油松花粉在儲藏過程中蛋白質(zhì)含量和功能性質(zhì)的變化情況，為油松花粉的儲藏提供一些依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)利用堿提酸沉法，分離提取油松花粉的蛋白，成本較低，省時(shí)高效，而且對實(shí)驗(yàn)儀器的要求不是很高，是一種很普遍的提取蛋白的方法，可以為后續(xù)大量的提取油松花粉中的蛋白提供參考，并為進(jìn)行深入研究蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油松花粉 山西省安澤縣惠原科貿(mào)有限責(zé)任公司；鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸 均為分析純。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；TG16A-WS型高速離心機(jī) 武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；JP-040ST型超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；868型酸度計(jì) 美國奧利龍公司；JA1203N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；其他常用玻璃儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油松花粉基本組成成分的測定 水分含量：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分含量：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗蛋白含量：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪含量：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；還原糖測定：GB/T 5009.7-2008《食品中還原糖的測定》。

1.2.2 油松花粉破壁方法 采用溫差破壁和超聲波破壁復(fù)合方法：將花粉置于-18℃冰箱內(nèi)冷凍24h，迅速置于60℃的熱水中攪拌30min，之后迅速冷卻至室溫25℃，之后放入超聲波儀器中進(jìn)行處理，超聲頻率40000Hz、超聲波功率為240W、超聲時(shí)間10min、超聲溫度為50℃，最后干燥后得破壁花粉[8-11]。

1.2.3 油松花粉蛋白等電點(diǎn)的測定 取4g花粉，以料液比1∶30加入120mL蒸餾水，放入超聲波破壁（40000Hz，240W，50℃，10min），之后調(diào)節(jié)pH10.04后，放入45℃恒溫水浴鍋，浸提60min，以3000r/min離心10min，取出上清液，并均勻倒入5個(gè)小燒杯，調(diào)節(jié)pH分別為2、3、4、5、6，再次以3000r/min離心10min，取出上清液，測定吸光度值。選取出吸光度值最小的一個(gè)區(qū)間，再以0.2為梯度，測定出準(zhǔn)確的等電點(diǎn)[12]。此時(shí)蛋白質(zhì)沉淀量最大，上清液的吸光度值最小。

1.2.4 油松花粉蛋白提取流程（采用堿提酸沉法提取） 破壁后的油松花粉→加入蒸餾水并調(diào)節(jié)pH為10→恒溫水浴鍋浸提→3000r/min、10min離心分離→分離出上清液→調(diào)節(jié)pH至油松花粉的等電點(diǎn)（pI）→3000r/min、10min離心分離→分離出沉淀物→水洗中和、均質(zhì)、干燥→得到蛋白[13]。

1.2.5 油松花粉蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算 油松花粉蛋白質(zhì)的提取率（%）=提取出的蛋白質(zhì)質(zhì)量/油松花粉中蛋白質(zhì)的含量×100。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用控制變量法，分別研究料液比、提取液pH、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素對油松花粉蛋白提取的影響[14]。

1.2.6.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 固定提取pH為10，溫度為45℃，提取時(shí)間為60min，離心速度為3000r/min，離心10min，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的條件下提取。

1.2.6.2 提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 固定料液比為1∶30（g/mL），溫度為45℃，提取時(shí)間為60min，離心速度為3000r/min，離心10min，分別在提取pH為8、9、10、11、12的條件下提取。

1.2.6.3 提取pH單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 固定提取pH為10，溫度為45℃，料液比為1∶30（g/mL），離心速度為3000r/min，離心10min，分別在提取時(shí)間為20、40、60、80、100min的條件下提取。

1.2.6.4 提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 固定提取pH為10，提取時(shí)間為60min，料液比為1∶30（g/mL），離心速度為3000r/min，離心10min，分別在提取溫度為25、35、45、55、65℃的條件下提取。

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，選用料液比、pH、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素為自變量，以油松花粉蛋白質(zhì)提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)[15]，確定出最佳提取條件。分析因素與水平實(shí)驗(yàn)因素見表1。

表1 因素水平表Table 1 Different levels of factors

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)平行測定3次，采用Minitab軟件和Excel對數(shù)據(jù)處理，其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 油松花粉基本組分測定結(jié)果

表2 油松花粉基本組分含量（%）Table 2 Basic chemical composition of pine pollen（%）

通過對油松花粉基本組分進(jìn)行測定[16]，測定結(jié)果由表2所示，該油松花粉的基本組分測定結(jié)果與參考文獻(xiàn)[17-21]記載均有一定差異，原因可能在于油松花粉的產(chǎn)地不同，生產(chǎn)的季節(jié)不同，這一點(diǎn)從不同參考文獻(xiàn)也可以說明。就該油松花粉的基本組分含量來看，還原糖和蛋白質(zhì)的含量都相對較高，就為日后實(shí)驗(yàn)研究油松花粉蛋白的理化性質(zhì)打下了良好的基礎(chǔ)。其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還可為日后油松花粉資源的選擇性開發(fā)利用提供參考。

2.2 油松花粉蛋白等電點(diǎn)的測定結(jié)果

圖1 油松花粉蛋白的等電點(diǎn)Fig.1 Isoelectric point of pine pollen

根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理可知，在堿性環(huán)境中提取，之后再樣品中加酸，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)的沉淀量最大，上清液中蛋白質(zhì)的含量是最低的，由此可以測得油松花粉蛋白的等電點(diǎn)（pI）。堿提酸沉法是很容易分離出樣品蛋白的方法，所以，要想優(yōu)化選擇油松花粉蛋白的提取條件，首先要測定出油松花粉蛋白的等電點(diǎn)。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)可以確定出油松花粉蛋白等電點(diǎn)的區(qū)間位于pH在3～4之間；進(jìn)一步研究結(jié)果表明（圖1），當(dāng)pH在3.6時(shí)，上清液吸光度值最小，由此可以得到油松花粉蛋白的等電點(diǎn)（pI）為3.6。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 料液比對油松花粉蛋白提取率的影響 料液比對油松花粉蛋白提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著料液比的增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸增加，在1∶30以后，蛋白質(zhì)的提取率接近穩(wěn)定，蛋白質(zhì)提取率的增加速度明顯減緩。當(dāng)料液比較低時(shí)，油松花粉中的蛋白質(zhì)不能充分的溶解，在進(jìn)行酸沉階段，去除的沉淀中會含有大量的蛋白造成提取率降低[22]；同時(shí)當(dāng)溶液量過大，成本上升，還會產(chǎn)生過多的廢液，而且由圖2可見，料液比在1∶30、1∶40和1∶50相差并不大，根據(jù)以上分析得出油松花粉蛋白提取的最佳料液比為1∶30（g/mL）。

圖2 料液比對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on protein yield

2.3.2 提取pH對油松花粉蛋白提取率的影響 堿提pH對油松花粉蛋白提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著提取pH的增加，蛋白質(zhì)的提取率先增大后減小，并且在pH為10時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率最大，可能是蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下溶解度會增大，但是隨著pH得繼續(xù)升高，堿性增強(qiáng)，會使得蛋白質(zhì)變性，內(nèi)部結(jié)構(gòu)會改變，而且蛋白質(zhì)會發(fā)生降解反應(yīng)，這樣使得蛋白質(zhì)的溶解度反而降低。同時(shí)，pH過高，蛋白質(zhì)會進(jìn)行不正常的化學(xué)反應(yīng)，蛋白質(zhì)會脫羧、脫氨、肽鍵斷裂產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[23]。根據(jù)以上分析可以說明，油松花粉蛋白提取的最佳pH為10。

圖3 pH對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction pH on protein yield

2.3.3 提取時(shí)間對油松花粉蛋白提取率的影響 堿提時(shí)間對油松花粉蛋白提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的提取率逐漸增大，在提取時(shí)間為100min時(shí)最大，這可能是因?yàn)椋弘S著提取時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)的溶解率會增大，但是增加一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解率達(dá)到最大，再延長提取時(shí)間，蛋白質(zhì)的提取率不會有明顯提高。提取時(shí)間為80、100min，兩者相比較，考慮到節(jié)省時(shí)間的因素，據(jù)此可以說明，油松花粉蛋白提取的最佳提取時(shí)間為80min。

圖4 堿提時(shí)間對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on protein yield

2.3.4 提取溫度對油松花粉蛋白提取率的影響 提取溫度對油松花粉蛋白提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)的提取率逐漸增大，在提取溫度為55℃的時(shí)候，提取率最高，可能的原因是隨著溫度的升高，會增加蛋白質(zhì)的溶解度，而且高溫使之前破壁不完全的花粉破壁，這樣蛋白質(zhì)的溶解度會明顯升高。但是提取的溫度不能太高，因?yàn)楦邷貢沟鞍踪|(zhì)變性，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[24]。綜合以上因素，油松花粉蛋白提取的最佳提取溫度為55℃。

圖5 堿提溫度對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on protein yield

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對料液比、提取pH、提取時(shí)間、提取溫度四因素進(jìn)行采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以蛋白質(zhì)的提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，確定油松花粉蛋白的最佳提取工藝。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for the orthogonal array design

極差R反映各因素作用的大小，極差越大的因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)所造成的影響也越大。由表3可知，RA（10.500）＞RB（4.600）＞RD（3.534）＞RC（1.000），四個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響次序?yàn)椋篈＞B＞D＞C，即料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響最大，提取pH的影響次之，其次為提取溫度，而提取時(shí)間對蛋白質(zhì)的提取率影響最小。

由表3中的極差分析可知，本實(shí)驗(yàn)的最佳提取組合為A3B3C2D2，即料液比1∶40（g/mL）、提取pH為11、提取時(shí)間80min、提取溫度55℃。

從表4的方差分析可知，料液比對油松花粉蛋白質(zhì)的提取率的影響顯著，而其他因素均不顯著。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

因?yàn)檎粚?shí)驗(yàn)確定出的最佳組合A3B3C2D2并不在正交表中，所以按此條件做3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。得到油松花粉蛋白的提取率為56.3%±0.3%，大于正交實(shí)驗(yàn)中的任意一組提取率，由此證明，此最佳提取工藝是可行的。

3 結(jié)論

油松花粉蛋白的等電點(diǎn)為3.6。影響油松花粉蛋白質(zhì)提取率各因素的主次順序是：料液比＞pH＞提取溫度＞提取時(shí)間，油松花粉蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為：料液比1∶40（g/mL）、pH為11、提取時(shí)間80min、提取溫度55℃，此時(shí)提取率可達(dá)56.3%。

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