常用防腐劑對黃燈籠辣椒醬腐敗菌抑菌作用的優化

李玲玲，仇厚援，陳文學，麥力文

（海南大學食品學院，海南海口570228）

醬腌菜營養豐富，為多種微生物的生長提供了良好環境。醬腌菜在開蓋后和長期貯藏過程中都容易發生腐敗變質，影響其腐敗變質的主要微生物是細菌、酵母菌和霉菌，這些微生物的大量生長繁殖造成了醬腌菜的霉變、腐敗[1-2]。Meldrum等發現相對于其他醬類調味品，辣椒醬更容易受到微生物的污染[3]。微生物污染是造成食品腐敗或是食源性疾病的一個重要因素[4]，因為微生物的大量繁殖[5]和部分霉菌代謝產物的積累[6]嚴重影響了食品的保藏期和安全性。因此需要添加適量的防腐劑來抑制微生物的生長繁殖，從而達到延長食品貨架期的效果。相對于天然防腐劑與生物防腐劑來講，化學合成防腐劑具有價格低廉、種類繁多、作用明顯等優點[7-8]。目前我國允許在醬腌菜中添加使用的防腐劑主要有苯甲酸鈉[9]、山梨酸鉀[10]、脫氫醋酸鈉[11]、尼泊金復合酯鈉[12]等幾種。這些防腐劑對每種菌的防腐效果都不相同，因此將幾種防腐劑合理的復配使用，通常比單獨使用效果更佳[13-14]。張顯久[15]和楊楠[16]也都曾做過防腐劑復配添加的實驗，對于延長保藏期的效果均比較明顯。

因此需開發一種高效、安全的復配型防腐劑來應對黃燈籠辣椒醬易腐敗變質的問題。本實驗所采用的供試菌為從黃燈籠辣椒醬中分離純化出的20種腐敗菌，分別測定4種常用防腐劑對此20種菌的最低抑菌濃度（MIC）和實驗菌的抑菌直徑，通過正交實驗優化出黃燈籠辣椒醬防腐劑復配配方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用菌株 均是從不含防腐劑的腐敗變質的黃燈籠辣椒醬中分離純化所得，共20種，其中細菌11種（A1-A11，A11在初分離時的數量最多）、酵母菌1種（B1）、霉菌8種（C1-C8，C8在初分離時數量最多，但同梯度濃度下的數量小于A11）；苯甲酸鈉（安息香酸鈉） 食品級，天津東大化工有限公司；山梨酸鉀 食品級，王龍集體有限公司；脫氫醋酸鈉（脫氫乙酸鈉） 食品級，廣州市安心生物制品有限公司；尼泊金復合酯鈉（對羥基苯甲酸復合酯鈉） 食品級，無錫江大百泰科技有限公司；孟加拉紅培養基（虎紅培養基） 購買于廣東環凱微生物科技有限公司。

PL3002型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BCD-232YMB型容聲冰箱 海信容聲（廣東）冰箱有限公司；DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱 上海-恒科儀器有限公司；HWS-430型恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠；MPL-HWS型恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠；GI540W型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司。

1.2 培養基的制備

營養瓊脂培養基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂18g，加蒸餾水1000mL，調制pH7.3±1，121℃滅菌20min；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）的配制參照沈萍[17]的方法；各菌所用培養基培養條件見表1。

表1 微生物的選擇性培養基及培養條件Table 1 Culture media and culture conditions of different microorganisms

1.3 實驗方法

1.3.1 防腐劑母液的配制及其倍比稀釋 根據《食品添加劑使用衛生標準》GB 2760-2011[18]中的規定，在腌漬蔬菜中，防腐劑單獨使用時最大使用量為：苯甲酸及其鹽類≤1g/kg，山梨酸鉀及其鉀鹽≤0.5g/kg，脫氫醋酸鈉≤0.3g/kg，尼泊金酯及其鈉鹽≤0.25g/kg。稱取定量的防腐劑粉末，溶解于無菌水中，按二倍稀釋法配制實驗防腐劑的6個濃度，防腐劑的濃度梯度見表2。

1.3.2 菌懸液的制備 參照國家標準GB 4789.2-2010[19]中菌落總數的測定方并稍作修改，將細菌、酵母菌、霉菌分別接種于各自的選擇培養基上按相應條件培養，待培養完成后，用接種環挑取單菌落于100mL無菌水中，振蕩10min，再取100μL該菌液涂布于各培養基平板上，分別培養24、48、72h后計數，按國家標準GB 4789.2-2010[19]中計算公式計算出所配菌懸液的活菌濃度，所得菌懸液濃度用無菌水調配至105CFU/mL，于4℃冰箱中保存。

表2 防腐劑的濃度梯度Table 2 The concentration gradient of preservatives

1.3.3 測定方法

1.3.3.1 MIC的測定 參照沈萍等[17]的方法并稍作修改。即在無菌條件下，將各防腐劑按表2所示的濃度分別添加于各培養基平板中，待培養基凝固后加入濃度為105CFU/mL的菌懸液，均勻涂布后恒溫培養并觀察。以不添加防腐劑只添加菌懸液為空白對照，以培養基平板上完全無菌生長時的防腐劑濃度為MIC。

1.3.3.2 抑菌圈直徑的測定 采用6mm濾紙片法[17]，將滅菌后的濾紙片在相應的防腐劑溶液中浸泡30min后取出，貼于已均勻涂布實驗菌的培養基平板上，每皿等距離貼三個平行的防腐劑濾紙片和一個空白對照，測定經培養后的抑菌圈直徑（抑菌直徑=防腐劑抑菌直徑－空白對照抑菌直徑）。

1.3.4 防腐劑復配添加量的確定 結合各腐敗菌的MIC及從腐敗變質的黃燈籠辣椒醬中分離時的菌落個數，選取生長繁殖能力較強、對防腐劑較為遲鈍、含量較多的腐敗菌作為復配防腐劑的實驗菌種。

從MIC結果中選擇4種防腐劑的合適的濃度范圍設計正交實驗，其中復配防腐劑的添加比例符合《食品添加劑使用衛生標準》GB 2760-2007附錄A.2的規定[18]。以4種防腐劑為因素，以實驗菌的抑菌直徑為考察指標，建立L16（45）正交實驗，確定黃燈籠辣椒醬防腐劑的復配配方，正交實驗因素水平見表3。

表3 正交實驗因素水平表（mg/mL）Table 3The factors and levels of orthogonal experiment（mg/mL）

2 結果與分析

2.1 MIC測定結果

四種常用防腐劑對黃燈籠辣椒醬腐敗菌的抑菌效果和其差異顯著性的結果如表4所示。

由表4可知，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉、尼泊金復合酯鈉對供試腐敗菌的抑菌效果不同。對于4種防腐劑的MIC分別分析其差異顯著性可知，苯甲酸鈉對A10、C5和C6三種菌的抑制作用最強，其MIC均為0.125mg/mL；山梨酸鉀對C4和C6兩種菌的抑制作用最強，其MIC均為0.0625mg/mL；脫氫醋酸鈉對A1、A3、A5、A6、A7、A8、A9、A10、C6九種菌的抑制作用較強，其MIC均為0.075mg/mL；尼泊金復合酯鈉對A6、A7、B1、C1、C4、C6六種菌的抑制作用較強，其MIC均為0.0625mg/mL。

表4 不同防腐劑對腐敗菌的MIC（mg/mL）Table 4 MIC’s of different preservatives against three typical spoilage bacteria（mg/mL）

綜合分析四種防腐劑MIC的差異顯著性可知，四種防腐劑對A11和C8的MIC最大，其MIC分別為0.05、0.05、0.3、0.25mg/mL，故A11、C8兩種菌對四種防腐劑的抗性最強。因此，選定A11、C8這兩種菌為防腐劑復配實驗菌。

2.2 正交實驗結果

以A11和C8兩種菌為實驗菌進行防腐劑復配實驗，以抑菌直徑為評價指標，得出正交實驗結果見表5，方差分析見表6。

表5 正交實驗結果Table 5 The results of orthogonal experiment

由表5和表6正交實驗設計和極、方差分析結果可知：四個因素對細菌11號（A11）抑制效果的主次順序為C＞A＞B＞D，且四種防腐劑對結果影響不顯著，極差分析得到最佳水平組合為A1B1C2D1，即添加復合防腐劑中苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.12mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.048mg/mL，尼泊金復合酯鈉濃度為0.06mg/mL時對細菌11號的抑制效果最好；四個因素對霉菌8號（C8）抑制效果的主次順序為A＞D＞C＞B，且僅苯甲酸鈉對結果影響顯著，極差分析得到最佳水平組合為A1B2C3D2，即添加復合防腐劑中苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.08mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.024mg/mL，尼泊金復合酯鈉濃度為0.04mg/mL時對霉菌8號的抑制效果最好。

表6 正交實驗方差分析表Table 6 The variance analysis of orthogonal design（random model）

實驗菌A11對應的防腐劑復配組合為A1B1C2D1，實驗菌C8對應的防腐劑復配組合為A1B2C3D2，為使兩種菌都能較好的被防腐劑抑制，應選擇較高濃度的防腐劑復配組合作為最終防腐劑復配組合，故選定A11所對應的防腐劑復配組合A1B1C2D1為實驗最佳配方，即添加復合防腐劑中苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.12mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.048mg/mL，尼泊金復合酯鈉濃度為0.06mg/mL。經驗證實驗，其對A11的抑菌圈直徑為6.83mm，為最佳優化方案。

3 結論與討論

從本實驗可知，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉和尼泊金復合酯鈉4種化學合成類防腐劑對細菌、酵母菌和霉菌的抑制作用明顯，本實驗最終篩選出的兩種菌分別為細菌和霉菌，與這一情況相似的是張顯久等[15]的研究，他對從開蓋后的辣椒醬中分離出的三株細菌、三株霉菌進行了有效的抑菌實驗，即添加了0.05%防腐劑的辣椒醬在開蓋后室溫下放置了25d才開始發霉。另外楊楠等[16]對三種防腐劑的復配實驗也達到了延長食品保質期的效果，因此本研究所得的防腐劑復配配方用于黃燈籠辣椒醬中時應該也能延長食品的保質期。

四種防腐劑對20種供試腐敗菌均有抑制作用，但是其抑菌效果不同。通過對其MIC結果的差異顯著性分析，可知A11和C8兩種菌對實驗所用四種防腐劑的抗性較強。通過正交優化得出黃燈籠辣椒醬復配防腐劑的配方為：苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.12mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.048mg/mL，尼泊金復合酯鈉濃度為0.06mg/mL，此最佳配方下測得A11的抑菌圈直徑為6.83mm。

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