正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化蘆筍嫩莖多酚的提取工藝

朱素英

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤274015)

植物多酚是一類以苯酚為基本骨架，苯環(huán)上含有多個(gè)羥基的次生代謝產(chǎn)物，在植物中含量豐富，包括簡(jiǎn)單多酚、單寧、黃酮類、原花青素等，研究表明，多酚類具有較強(qiáng)的清除自由基的能力和抗氧化活性，可使機(jī)體免受代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物的損害［1］。蘆筍(Asparagus officinalis)學(xué)名石刁柏，百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物，是一種藥食兩用植物，其嫩莖供食用，鮮嫩可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“蔬菜之王”美譽(yù)。同時(shí)蘆筍還具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、降血脂、抗腫瘤等作用［2］。蘆筍含有豐富的類黃酮物質(zhì)(主要是蘆丁)、多糖、類胡蘿卜素等，其中類黃酮類物質(zhì)屬于多酚類［3］。目前對(duì)于蘆筍黃酮類以及藥理研究的比較多，但對(duì)于生理活性多樣的多酚類物質(zhì)的提取工藝方面的研究仍是空白。因此本實(shí)驗(yàn)以正交設(shè)計(jì)對(duì)蘆筍多酚進(jìn)行進(jìn)行提取優(yōu)化，以期為蘆筍的進(jìn)一步加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蘆筍嫩莖 于5月份采自菏澤沙土鎮(zhèn)田間，真空干燥箱中干燥至恒重，稱取200g，粉碎過(guò)40目篩，備用;Folin－Ciocalteau試劑 上海荔達(dá)有限公司;沒(méi)食子酸(GA)、乙醇等 均為分析純。

RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HH－8數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠;DZF－6050型真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)公司;DL－4型飛鴿臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FW－100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;TU－1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 蘆筍多酚的提取

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取沒(méi)食子酸10mg，用乙醇溶解定容于100mL容量瓶中，配制成0.1mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中。加入稀釋10倍Folin－Ciocalteau 試劑 1mL，4mL 10% 的 Na2CO3溶液，定容至10mL。于40℃水浴反應(yīng)40min后在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。平行測(cè)定3次。得回歸曲線Y=8.123X+0.065，R2=0.9981;其中X為沒(méi)食子酸的濃度(mg/mL)，Y為吸光度，線性關(guān)系良好。

1.2.2 蘆筍多酚的提取工藝和含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取一定量的白蘆筍粉，置于50mL錐形瓶中，按照各因素考察條件進(jìn)行提取，過(guò)濾，定容，按照1.2.1，進(jìn)行吸光度的測(cè)定，測(cè)得的吸光度代入回歸方程進(jìn)行計(jì)算各提取液的總多酚沒(méi)食子酸當(dāng)量濃度(mgGAE/mL)，以及多酚總質(zhì)量，計(jì)算多酚得率［5］。

蘆筍多酚得率(%)=［提取液濃度(mgGAE/mL)×提取液體積(mL)］/［白蘆筍粉質(zhì)量(g)×1000］×100

1.2.3 蘆筍多酚提取工藝的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)蘆筍多酚含量影響較大的4個(gè)因素，設(shè)置誤差空列，采用L16(54)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考察各因素對(duì)多酚提取量影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The levels and factors of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)蘆筍多酚提取的影響

精確稱取蘆筍細(xì)粉1g，按照固定條件80℃水浴溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間60min。料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，進(jìn)行提取，結(jié)果如圖 1。

圖1 不同料液比對(duì)蘆筍多酚得率的影響Fig.1 Effect of solid－to－solvent ratio on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

從圖1可以看出，隨著料液比的增加，多酚得率逐漸增加，從1∶5～1∶15增加較快，從1.50%增加到6.35%，但在1∶15～1∶30范圍內(nèi)，多酚的提取率增幅不大，僅從6.35%增加到6.81%，說(shuō)明多酚的飽和濃度在1∶15左右，溶劑少，多酚提取不完全，溶劑多，造成溶劑的浪費(fèi)，所以對(duì)于蘆筍多酚的提取適宜的料液比是1∶15左右。

2.2 提取溫度對(duì)蘆筍多酚提取的影響

準(zhǔn)確稱取1.0g的白蘆筍粉末，以1∶15的料液比，提取時(shí)間60min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度分別選擇 20、40、60、80、100℃條件下提取，結(jié)果如圖 2。

由圖2可知，在蘆筍多酚提取過(guò)程中，隨著溫度從20℃增長(zhǎng)到80℃，提取的蘆筍多酚得率逐漸增大，80℃達(dá)到6.24%，而到100℃又有所下降。這說(shuō)明溫度的增加有利于多酚物質(zhì)的溶解度，但溫度過(guò)高，會(huì)造成多酚物質(zhì)的降解［6］，導(dǎo)致提取量降低。因此，為了保護(hù)多酚的生物學(xué)活性，以及節(jié)約經(jīng)濟(jì)的原則，多酚提取的適宜溫度是80℃。

圖2 不同提取溫度對(duì)蘆筍多酚得率的影響Fig.2 Effect of the different extraction temperature on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

2.3 提取時(shí)間對(duì)蘆筍多酚的得率的影響

稱取蘆筍干燥粉末1.0g，提取溫度80℃，料液比1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 80%，提取時(shí)間分別為 30、60、90、120、150min，考察提取時(shí)間對(duì)蘆筍多酚得率的影響。

由圖3可以看出，增大提取時(shí)間，多酚得得率也隨著增加，90min時(shí)，提取率達(dá)到最大值，大于90min，提取率趨于穩(wěn)定，并有所下降。這說(shuō)明在一定提取時(shí)間范圍內(nèi)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于多酚物質(zhì)的釋放，但若提取時(shí)間超過(guò)這個(gè)范圍，浸出的多酚物質(zhì)，在溶液中被氧化，導(dǎo)致提取率降低［5］。

圖3 不同提取溫度對(duì)蘆筍多酚得率的影響Fig.3 Effect of the different extraction time on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

2.4 乙醇濃度對(duì)蘆筍多酚提取的影響

稱取蘆筍干燥粉末1.0g，提取溫度80℃，料液比1∶15，乙醇濃度分別為20、40、60、80、100%，考察乙醇濃度對(duì)蘆筍多酚得率的影響。

由圖4可以看出，隨著乙醇濃度的增加，總多酚的得率逐漸增加，60%時(shí)得率最大，隨后逐漸降低。說(shuō)明在乙醇濃度60%時(shí)，多酚的浸出最多。植物體內(nèi)多酚常與蛋白質(zhì)多糖等大分子通過(guò)氫鍵、疏水鍵等形成復(fù)合物，乙醇濃度過(guò)低時(shí)，水含量高，不能破壞多酚與大分子之間的鍵［7］，多酚提取的得率不高;研究表明，在中等極性溶劑中多酚類提取的得率較高［8］;乙醇濃度過(guò)高，會(huì)造成脂溶性成份浸出增加，影響多酚的提取，進(jìn)而降低多酚的得率［9］。

圖4 不同乙醇濃度對(duì)蘆筍多酚得率的影響Fig.4 Effect of the different ethanol concentration on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

2.5 蘆筍多酚提取工藝優(yōu)化

在單因素的分析的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為實(shí)驗(yàn)因素，并設(shè)置誤差空列項(xiàng)，采用5因素4水平L16(5)4進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化蘆筍多酚的提取工藝參數(shù)。結(jié)果如下，各因素對(duì)蘆筍多酚影響大小依次為A＞B＞C＞D，極差分析顯示，影響最大的因素為乙醇濃度，R值為5.09，其次是提取溫度、提取時(shí)間，料液比影響最小。最佳因素組合為A2B4C2D3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and result for the four variables studied

2.6 實(shí)驗(yàn)各因素的顯著性分析

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，從表3可以看出，各因素對(duì)蘆筍多酚得率的影響次序?yàn)?A＞B＞C＞D，與極差分析結(jié)果一致，其中以乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響最大，達(dá)到顯著水平(p＜0.05)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

2.7 對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

因最佳因素組合為A2B4C2D3不在正交表中，所以需要對(duì)最佳因素進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即精確稱取蘆筍粉1.0g，三份，以1∶15的料液比加入50%的乙醇，80℃水浴條件下提取60min，得到蘆筍多酚的得率為6.82%、6.95%、6.93%，平均得率為6.90%。RSD為1.01%，可以看出，該提取工藝比較穩(wěn)定，可以達(dá)到優(yōu)化的目的。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，蘆筍多酚提取優(yōu)化的最佳因素條件為料液比1∶15，乙醇濃度50%，80℃水浴條件下提取60min，在此條件下，蘆筍多酚的平均得率可達(dá)6.90%。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，可普及推廣，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以看出蘆筍多酚含量較高，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可為蘆筍進(jìn)一步加工利用奠定基礎(chǔ)。

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