獼猴B病毒gB蛋白特異性抗原表位的合成和表達

隋麗華，劉 一，趙彥斌，張小飛，崔曉霞，葉華虎，白杰英，許 琴，孫兆增，曾 林

(軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071)

獼猴B病毒(Macaque B virus)又獼猴皰疹病毒，是人獸共患病病毒。B病毒在猴體內的存在比率隨著年齡的增加，陽性率越來越高，在有些飼養場的老年猴群中陽性率在90%左右。B病毒陽性的獼猴，終生攜帶病原，傳染性較強，不僅嚴重影響實驗結果，造成人力物力的極大浪費，而且飼養人員與實驗人員感染后死亡率及高，幸存者也會留下神經后遺癥［3－8，12－14］。因此，及時、準確的檢測出 B病毒，并控制其傳播，對于獼猴的生產和人獸共患病的防控，具有重要意義［11］。

B病毒為Ⅳ級生物安全防護病原，因此在研制獼猴B病毒的檢測試劑時，用全病毒做抗原檢測抗體需在3級以上實驗室完成，危險性高、分離培養耗時長，局限性大［4］。而它與人的單純皰疹病毒1型(human simple herpes virus-1，HSV-1)和人的單純皰疹病毒2型(human simple herpes virus-1，HSV-2)病毒具有較強的抗原交叉性，目前多用人單純皰疹病毒做抗原替代獼猴B病毒，但作為診斷試劑，要求靈敏度高、特異性強，才能更好地區別 B 病毒與其它皰疹病毒［1，2，10］。目前，用于B病毒檢測的重組抗原主要是其囊膜蛋白gB、gC和gD，gC蛋白作為重組抗原特異性最高，但檢出率低于gB，gD的檢出率和特異性都較差，gB重組蛋白作為抗原，檢出率最高，但作為囊膜蛋白，其抗原性強，分子量巨大，可溶性抗原生產困難。本研究利用B病毒高度保守的gB基因，通過構建B病毒gB基因原核表達載體，并利用原核表達系統進行表達，期望獲得靈敏性和特異性較好的重組蛋白，為獼猴B病毒檢測試劑盒的研制奠定基礎［8，9，15］。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

高純質粒小量快速提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、T4 連接酶、E.coli DH5a、BL21(DE3)pLysS 菌株購自北京博邁德生物公司;2×Taq PCR Master Mix購自上海捷瑞生物工程有限公司;Bam HⅠ和XhoⅠ內切酶、pMD 18-T Vector載體均為大連寶生物公司產品;IPTG為sigma公司產品。

1.2 引物設計

為了將gB基因片段定向連接pET-22b載體，根據NCBI數據庫上gB基因序列和載體的特異性位點，設計1對引物，上游引物:5＇-cgc gga tcc gca cag ctg gcc ctg gat gaa-3＇，下游引物:5＇-ccg ctc gag ttc ttc tgg tgc aac aac-3＇。

1.3 基因合成

從GenBank上獲得B病毒的 gB蛋白序列，并將其與人的單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒等的 gB蛋白序列進行比較。選擇 gB蛋白序列中，抗原表位強，但與其它皰疹蛋白同源性較低的序列，進行合成，合成序列的總長度為597 bp，基因片段的兩端酶切位點為EcolⅠ和NdeⅠ。基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成，命名為gB合。

1.4 pET-22b載體的構建

利用上述引物進行PCR擴增，引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點。將回收后的gB基因片段連接到pMD 18-T Vector載體。將連接后的產物轉化E.coli DH5a感受態細胞，利用PCR方法篩選出陽性質粒pMD18-T Vector-gB合;將此陽性質粒用 Bam HⅠ和XhoⅠ進行酶切，回收后的片段連接到 pET-22b載體上，轉化到BL21(DE3)pLysS感受態細胞。

1.5 合成基因的誘導表達

將pET-22b-gB轉化BL21(DE3)pLysS感受態細胞，挑取單菌落在含氨芐抗性的LB液體培養基中37℃培養至OD值為0.6，加入終濃度為0.3 mM的IPTG，室溫誘導4 h。取50 μL誘導后的菌液與等體積的2×上樣緩沖液混合，煮沸5 min。樣品上樣量為20 μL，利用10%的SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達情況。

1.6 重組蛋白的純化

1L LB液體培養基中按1%接種過夜培養菌，37℃，220 rpm培養 3.5 h，加入 IPTG的終濃度至0.3 mM，室溫27.3℃誘導表達4h。離心去上清，用每克4 mL的裂解緩沖液重懸，－20℃過夜。采用鎳結合蛋白親和層析柱純化目的蛋白，用包含20 mM咪唑的沖洗緩沖液去除非特異結合的蛋白，含250 mM咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫，收集純化蛋白，進行SDS-PAGE電泳，樣品上樣量為15 μL，分離膠的濃度為10%。利用考馬斯亮藍進行染色，觀察電泳結果，并照相。利用 Western-blot方法，檢測重組蛋白與B病毒陽性血清的反應原性。

2 結果

2.1 基因合成結果分析

gB合基因重組質粒的 PCR鑒定見圖1，擴增得到目的片段，其大小為597bp，基因片斷與預期結果基本相符。

注:M:DNA分子量標準;1:重組質粒p5X-gB合的PCR結果。圖1 重組質粒p5X-gB合PCR鑒定Note:M:DNA marker;Lane 1:The PCR results of the product of recombinant plasmid p5X-gB合.Fig.1 PCR amplification of the recombinant plasmid P5X-gB

2.2 pMD 18-T Vector-gB合載體構建結果分析

將基因片段定向連接到pMD 18-T Vector載體。將連接后的產物轉化 E.coli DH5a感受態細胞，利用菌液PCR及雙酶切篩選出陽性質粒pMD 18-T Vector-GB合，結果如圖 2。

注:A(PCR鑒定):M:DNA分子量標準;1:重組質粒pMD 18-T Vector-gB合PCR鑒定結果B(雙酶切鑒定):M:DNA分子量標準;1:重組質粒pMD 18-T Vector-gB合的BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切結果。圖2 重組質粒pMD 18-T Vector-gB合PCR及雙酶切鑒定Note:A(PCR identification):M:DNA marker;Lane 1:The PCR results of the product of recombinant plasmid pMD 18-T Vector-gB合 PCR.B(Double Enzyme digestion identification):M:DNA marker;Lane 1:the productof of Enzyme digestion with BamHⅠ和 XhoⅠofrecombinant plasmid pMD 18-T Vector-gB合.Fig.2 PCR and Enzyme digestion amplification of the recombinant plasmid pMD 18-TVector-gB

2.3 pET-22b-gB合載體的構建

用雙酶切方法將陽性基因質粒從重組質粒pMD 18-T Vector-gB合上分離后，膠回收鑒定，將陽性基因片段通過T4連接酶定向連接到pET-22b載體。轉化到具有表達性的BL(DE3)21感受態細胞上，經PCR和雙酶切鑒定，成功建立pET-22b-gB重組質粒并大量擴增，結果如圖3。

注:A(PCR鑒定):M:DNA分子量標準;1:重組質粒pET-22b-gB PCR鑒定結果B(雙酶切鑒定):M:DNA分子量標準;1:重組質粒pET-22b-gB的BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切結果圖3 重組質粒pET-22b-gB PCR及雙酶切鑒定Note:A(PCR identification):M:DNA marker;Lane 1:The PCR results of the product of recombinant plasmid pET-22b-gB PCR B(Double Enzyme digestion identification):M:DNA marker;Lane 1:the productof of Enzyme digestion with BamHⅠ和XhoⅠofrecombinant plasmid pET-22b-gB.Fig.3 PCR and Enzyme digestion amplification of the recombinant plasmid pET-22b-gB

2.4 合成基因的誘導表達

將pET-22b-gB合轉化BL21(DE3)pLysS感受態細胞進行誘導表達，經SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達情況，如圖4，在約26×103處出現目的蛋白條帶，與預期重組蛋白的分子質量吻合。

注:M:蛋白分子質量標準;1:pET-22b對照;2:pET-22b-gB誘導表達菌。圖4 SDS-PAGE檢測重組蛋白表達Note:M:protein molecular standard;1:pET-22b plasmid control;2:Induce products of pET-22b-gB.Fig.4 Detection of recombinant protein expression by SDS-PAGE

2.5 重組蛋白的純化

重組菌誘導表達后，柱層析純化的蛋白經SDSPAGE電泳，3－5為A280不同吸光度值特異性洗脫目的條帶，3、4未出現目的條帶，5開始出現目的條帶，吸光度值為79，如圖5。

2.6 重組蛋白Western blot分析

純化的目的蛋白，通過 Western-blot分析，證實重組蛋白與B病毒陽性血清具有反應原性。如圖6。

3 討論

病毒囊膜糖蛋白在病毒入侵宿主細胞的過程中作用顯著。據 Perelygina等［17］報道，用于 B病毒診斷的糖蛋白 gB、gC、gD敏感性分別為 100%、97.3%、88%。為了獲得更靈敏、特異的 B病毒檢測方法，國內已有利用基因工程技術產生猴BV囊膜重組蛋白，王瓊等［8］用桿狀病毒作為表達載體表達了猴BV gB蛋白片段，段博芳等［16］用猴 B病毒gB基因在昆蟲細胞中獲得表達，肖鏡等［3］表達了猴B病毒gD蛋白片段，已證實重組蛋白具有較好的抗原性。

注:M:蛋白分子質量標準;1:pET-22b質粒對照;2:pET-22b-gB誘導表達菌細胞破碎產物;3－5:特異性洗脫蛋白。圖5 SDS-PAGE檢測重組蛋白表達、純化Note:M:protein molecular standard;Lane 1:pET-22b plasmid control;Lane 2:Induced products of pET-22b-gB;Lane 3－5:specific elution protein.Fig.5 Detection of recombinant protein expression and Purification by SDS-PAGE

注:M:蛋白分子質量標準;1:pET-22b-gB Western-blot結果;2:pET-22b對照。圖6 重組蛋白Western-blot分析Note:M:protein molecular standard;Lane 1:products of Western-blot of pET-22b-Gb;Lane 2:pET-22b plasmid control.Fig.6 Western blot analysis of pET-22-gB

本試驗選擇猴BV的gB蛋白的抗原表位強、且與其它皰疹病毒蛋白同源性較低的序列進行合成，并對其密碼子進行了優化，采用pET-22b載體，通過原核表達系統，選擇適于誘導表達的IPTG濃度、誘導溫度及時間，避免產生包涵體，成功獲得 pET-22b-gB可溶性表達產物。通過鎳結合蛋白親和層析柱純化，純化過程相對簡單，具有易于大量制備的優點，獲得了純度約為85%的目的蛋白，通過Western-blot證實，B病毒 gB基因重組蛋白具有較好的抗原性，為進一步取代全病毒作為抗原的ELISA方法奠定了基礎。

［1］Jennifer L H，Peter A B.B-virus(cercopithecine herpesvirus 1)infection in humans and macaques:potential for zoonotic disease［J］.Emerg Infect Dis，2003，9(2):246 －250.

［2］Yamaoto H， OhsawaK， Walz SE， etal.Validationof anenzyme-linked immunosorbentassay kitusing herpesvirus papio2(HVP2)antigen for detection of herpesvirus simiae(B virus)infection in rhesus monkeys［J］.Comp Med，2005，55(3):244－248.

［3］肖鏡，付瑞，賀爭鳴，等.猴B病毒gD-多肽ELISA檢測方法的建立［J］.實驗動物科學，2008，25(2):20 －23.

［4］Weigler B J.Biology of virus in macaque and human hosts a review ［J］.Clin Iect D is，1992，14:555 －567.

［5］Xuan X，Kojima A，Murata T，et al.Analysis of canine herpes virus gB，gC and gD expressed by a recombinant vaccine virus［J］.Arch Virol，1997，142:1003 － 1010.

［6］Besecher MⅠ，Harden H E，Li G，et al.Discovery of herpes B virus-encoded micro RNAs［J］.Virology，2009，83(7):3413 －3416.

［7］王淑芬，李冠民，吳小閑，等.醫學實驗動物監測手冊 實驗動物微生物學、寄生蟲學監測分冊［M］.北京:衛生部醫學實驗動物管理委員會，1992:69.

［8］王瓊，吳志蕾艾，軍，等.猴B病毒gB基因桿狀病毒表達載體的構建［J］.云南畜牧獸醫，2010，(1):4 －5.

［9］吳春濤，李艷梅，唐少剛.牛皰疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2010，40(12):1259－1264.

［10］盤寶進.用B病毒ELISA和人單純皰疹病毒Ⅰ型酶免疫法檢測食蟹猴血清中B病毒相關抗體的研究［J］.廣西畜牧獸醫，2005，21(1):10 －12.

［11］王吉，衛禮，鞏薇，等.2003－2008年我國實驗猴 BV抗體檢測結果及抗體水平變化規律的分析［J］.中國實驗動物學報，2010，18(3):268 －270.

［12］Huff JL，Barry PA.B-virus(Cereopithecine herpesvirus 1)infection in humans and macaques:potential for zoonotic disease［J］.Emerg Infect Dis，2003，9(2):246 －250.

［13］Focher F，Lossani A，Verri A，et al.Sensitivity of Mondey Bvirus(Cercopithecine herpesvirus 1)to antiviral drugs:role of thymidine kinase in antiviral activities of substrate analogs and acyclonucleosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(6):2028－2034.

［14］饒這華，劉曉明，王海英，等.人工馴養條件下食蟹猴 B病毒抗體水平變化規律研究［J］.中國比較醫學雜志，2007，17(1):12－14.

［15］練蓓，程安春，汪銘書.皰疹病毒gC基因及其編碼蛋白研究進展.中國動物傳染病學報，2009，17(2):82－86.

［16］段博芳，王瓊，段綱，等.猴B病毒gB基因在昆蟲細胞中的表達.中國人獸共患病學報，2012，28(7):674 －678.

［17］Ludmilaperelygina，Irina patru sheua，et al.Production of herpes of Bvirus recombinant glycoproteins and evaluation oftheir diagnostic potential［J］.J Clin Microbiol，2005，43(2):620 －628.DOI:10.1128/JCM.43.2.620 －628.2005.