西藏小型豬肋軟骨細胞的分離培養及鑒定

劉 薇，史俊文，岳 敏，張婷婷，唐 華，袁 進，肖 東，顧為望

(1.南方醫科大學 比較醫學研究所暨實驗動物中心，2.腫瘤研究所，廣州 510515)

豬在解剖、生理、生化代謝等方面與人類十分相似，近年來將豬用作醫學實驗動物呈越來越普遍的趨勢［1］。軟骨細胞是一種高分化的細胞，人體關節損傷之后，關節軟骨在體內不能增殖修復受損關節，用組織工程的方法制作人工關節為臨床上治療關節損傷提供了一種可能的方法，可以通過將軟骨細胞種植在特殊材料的支架上，構建人工組織，來修復受損關節［2，3］。小型豬體型適中，價格經濟，獲得容易，是進行關節軟骨損傷的良好實驗材料［4］。西藏小型豬是由南方醫科大學實驗動物中心顧為望教授等人于2004年由西藏自治區引種至廣州培育而成的小型豬品系，在近幾年，已基于其建立了幾種轉基因動物模型［5，6］。本研究擬分離培養西藏小型豬肋軟骨細胞，并對其進行鑒定，為后續的軟骨組織工程研究提供必備的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

西藏小型豬:3日齡普通級雄性西藏小型豬1頭，南方醫科大學實驗動物中心提供【SCXK粵2011-0015】。

小鼠:8周齡BALB/c小鼠一只，南方醫科大學實驗動物中心提供【SCXK粵2011-0015】。

1.1.2 主要試劑及耗材

胎牛血清、高糖DMEM培養基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺購自 Hyclone公司。青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、DMSO等購自 Invitrogen公司。DAPI、甲苯胺藍染料購自sigma公司。兔抗人Aggrecan一抗購自SANTA公司，鼠抗人CollagenⅡ一抗購自Invitrogen公司，羊抗兔和羊抗鼠Alexa Fluor 555紅色熒光標記二抗購自 Invitrogen公司。培養瓶及培養板等購自Corning公司。其余試劑為國產或進口化學純或分析純。

軟骨細胞完全培養基配方:DMEM培養基，加入10%胎牛血清、維生素 C(終濃度為50 μg/mL)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

西藏小型豬肋軟骨細胞(PCCs)分離培養:將3日齡西藏小型豬過量麻醉，處死，腹部皮膚剃毛，碘酊、75%酒精消毒，剪開腹部皮膚，無菌剪取肋軟骨一段，置于裝有含雙抗的 PBS的10 mm平皿中，運回超凈臺進行后續操作。將取下的肋軟骨用含雙抗的PBS洗兩遍，分離表面附著的軟骨膜、肌肉等組織，將分離好的肋軟骨剪成0.1 mm3的小碎塊，收集到15 mL離心管中，加入0.1% Ⅱ型膠原酶2 mL，消化30 min，PBS洗兩遍，然后加入新鮮 0.1%Ⅱ型膠原酶5 mL，37℃培養箱內消化5 h，每1小時吹打一次，觀察大部分軟骨塊消化后，加入完全培養基終止消化，200 g，4℃離心10 min，棄上清，加入完全培養基，轉入25 cm2細胞培養瓶中，于CO2培養箱內培養(培養條件:37℃、5%CO2、飽和濕度)。當原代細胞生長達80%～90%融合時，進行傳代。先吸除舊培養液，PBS洗滌 2遍，棄 PBS并加入0.25%胰酶進行消化，37℃培養箱中消化約5 min，鏡下觀察細胞消化情況，當大多數細胞變圓，立即加入2 mL完全培養基終止消化，然后仔細吹打細胞懸液，將細胞懸液收集至15mL離心管中，200 g，4℃離心10 min。棄上清液后，再用完全培養液重懸細胞，并輕輕吹打使細胞分散均勻，傳入新的培養皿中繼續培養。

小鼠肋軟骨細胞(MCCs)分離培養:取8周齡BALB/c小鼠一只，參照以上西藏小型豬肋軟骨細胞分離培養的方法分離培養其肋軟骨細胞。

西藏小型豬胚胎成纖維細胞(PEFs)和小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的培養:使用本實驗室凍存的PEFs［7］和 MEFs，復蘇，傳代至 P5，備用。

1.2.2 西藏小型豬肋軟骨細胞的鑒定

甲苯胺藍染色是軟骨細胞的特異性染色，原理是軟骨細胞分泌的蛋白聚糖經甲苯胺藍染色顯色為異染的藍紫色。軟骨細胞特異性分泌蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型膠原蛋白(CollagenⅡ)，通過對兩種蛋白的檢測陽性可證明所分離培養的細胞是軟骨細胞［8］。本實驗分別以 PEFs和 MEFs為陰性對照，對所分離培養的PCCs和MCCs進行甲苯胺藍染色鑒定以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光染色鑒定，如果待鑒定的PCCs和MCCs為甲苯胺藍陽性及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光陽性，即可證明所分離培養的PCCs為軟骨細胞。

甲苯胺藍染色:0.5 g甲苯胺藍溶于100 mL PBS中配成0.5%甲苯胺藍染液，將以上四種細胞傳代至3.5 cm平皿中，PCCs和 MCCs均為 P1代，PEFs和MEFs為P5代，四種細胞分別用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗三次，甲苯胺藍染色30 min，光鏡下觀察拍照。

取西藏小型豬膝關節處5 mm×5 mm×5 mm軟骨組織 (用作細胞染色的陽性對照)，按照常規步驟進行固定、脫水、石蠟切片的制作。將石蠟切片脫蠟去水，用以上甲苯胺藍染色液染色30 min，95%酒精分化5 s，浸入二甲苯5 min，中性樹膠封片。

蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光檢測:在六孔板內鋪蓋玻片，四種細胞分別各接種兩個孔，制作細胞爬片，待細胞密度達到70% ～80%時，PBS洗三次，用4%多聚甲醛將細胞固定10 min，PBS洗三次，0.5%Triton-100透化 10 min，PBS洗三次，山羊血清封閉20min(常溫)，加入KB稀釋的一抗(稀釋倍數:Aggrecan和 CollagenⅡ均為 1∶200)，37℃孵育2 h，PBS洗三次，加入 KB稀釋的紅光二抗(80μl/片)，37℃避光孵育 1 h，PBS 洗三次，避光加DAPI(0.2 mg/μL)10 μL 于載玻片上，加入等量的防熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片(細胞面朝下)，指甲油封片，正置熒光顯微鏡下觀察。

抗體稀釋液KB十倍儲存液的配制方法:Tris 1.21 g;NaCl 8.8 g;BSA 3 g溶于100 mL ddH2O中。

2 結果

2.1 細胞形態

原代培養24 h后，可見西藏小型豬肋軟骨細胞開始貼壁生長，細胞形態呈三角形、梭形、成纖維狀，細胞核為圓形或橢圓形，位于胞體中心，細胞在培養3天后，融合度達到90%左右。而同期培養的小鼠肋軟骨細胞，則呈現圓形和多角形兩種形態，其中圓形細胞占大多數，且細胞長滿后排列緊密，呈現典型的“鋪路石”狀。PCCs雖然為成纖維細胞狀，但是與典型的成纖維細胞PEFs相比，PCCs的細胞大小要小很多，因此它并不同于成纖維細胞(圖1，封二)。

注：PEFs:西藏小型豬胚胎成纖維細胞；PCCs: 西藏小型豬肋軟骨細胞；MCCs:小鼠肋軟骨細胞；MEFs：小鼠胚胎成纖維細胞圖1 西藏小型豬肋軟骨細胞的原代培養Note: PEFs: pig embryonic fibroblasts; PCCs: pig rib chondrocytes; MCCs: mouse rib chondrocytes;MEFs: mouse embryonic fibroblastsFig.1 Primary culture of rib chondrocytes of the tibetan miniature pig

2.2 甲苯胺藍染色

經甲苯胺藍染色可見，西藏小型豬關節軟骨組織甲苯胺藍染色陽性，軟骨基質為異染的藍紫色，切片上可見處于不同成熟階段的軟骨細胞，而所分離培養的PCCs和MCCs均呈甲苯胺藍染色陽性，軟骨細胞內可見藍紫色異染顆粒(圖2，封二)。

注: A: PEFs; B: PCCs; C: MEFs; D: MCCs; E: 西藏小型豬關節軟骨組織切片圖2 西藏小型豬肋軟骨細胞甲苯胺藍染色Note: A: PEFs; B: PCCs; C: MEFs; D: MCCs; E: histological sections of articular cartilage of Tibetan miniature pigsFig.2 Toluidine blue staining of tibetan miniature pigs rib chondrocytes

2.3 蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光

經免疫熒光檢測，PCCs和MCCs均呈蛋白聚糖和Ⅱ型膠原陽性(圖3，見彩插1)。

注：藍色示DAPI標記的細胞核；紅色示蛋白聚糖和II型膠原；PEFs:西藏小型豬胚胎成纖維細胞；PCCs: 西藏小型豬肋軟骨細胞；MCCs:小鼠肋軟骨細胞，MEFs：小鼠胚胎成纖維細胞圖3 西藏小型豬肋軟骨細胞免疫熒光染色Note: blue: nucleus marked by DAPI; red: Aggrecan and Collagen II; PEFs: pig embryonic fibroblasts;PCCs: pig rib chondrocytes; MCCs: mouse rib chondrocytes; MEFs: mouse embryonic fibroblastsFig.3 Immunofluorescence stain of tibetan miniature pigs rib chondrocytes

3 討論

軟骨主要由軟骨細胞和軟骨基質組成，采用膠原酶消化的方法就可以獲得種類單一的軟骨細胞。軟骨基質主要包括膠原和蛋白聚糖，其中Ⅱ型膠原占膠原的95%，軟骨細胞分泌的蛋白聚糖可以通過甲苯胺藍染色顯色為異染的藍紫色，因此，可以采用甲苯胺藍染色法對所分離培養的軟骨細胞進行鑒定，同時用Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的免疫熒光也可以對軟骨細胞進行鑒定。

本實驗采用二步消化法成功分離培養獲得西藏小型豬肋軟骨細胞，所培養的原代西藏小型豬肋軟骨細胞呈三角形、梭形及成纖維狀。而典型的大小鼠和兔的軟骨細胞均是圓形與多角形的，細胞密集時會呈現“鋪路石”狀［8，9，10］，本實驗同期培養的小鼠原代肋軟骨細胞也呈現圓形和多角形，與文獻一致。經甲苯胺藍染色以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫熒光反應，均證實所分離培養的PCCs為軟骨細胞。因此，西藏小型豬的肋軟骨細胞的特殊形態，可能與豬這個物種有關。PCCs的成纖維狀與典型的成纖維細胞并不相同，由圖1可以看出，與PEFs相比，PCCs要小很多，說明兩者有很大的形態差異。

本實驗成功分離了西藏小型豬的肋軟骨細胞，這為進一步用西藏小型豬進行軟骨損傷修復的研究提供了良好的實驗材料。

(本文圖1，2見封二，圖3見彩插1。)

圖1 野生型實驗組小鼠肝組織Fig.1 Liver biopsy of Wild-type experimental group mouse

圖2 野生型對照組小鼠肝組織Fig.2 Liver biopsy of Wild-type control group mouse

圖3 野生型實驗組小鼠肝組織切片（HE）Fig.3 Liver biopsy of Wild-type experimental group mouse(HE)

圖4 敲基因型實驗組小鼠肝組織切片（HE）Fig.4 Liver biopsy of Knock genotype experimental group mice(HE)

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