GDF－9 和 BMP－15 在不同品系小鼠中的多態性和生殖能力關聯分析

殷昆侖，張長勇，王天奇，暴 國，付淑霞，何嘉玲，孫德明

(1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730;2.國家人口計生委科學技術研究所，北京 100081)

生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF－9)和骨形態發生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP－15)是由卵母細胞分泌的兩種生長因子，對哺乳動物的正常生殖能力是不可或缺的［1］。GDF－9和BMP－15均屬于轉錄生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)超家族蛋白中的成員，其中GDF－9是第一個被證實與卵泡發育相關的基因。在小鼠，缺失基因GDF－9時卵泡發育被阻止在早期階段而導致不孕［2］，此后不久，在綿羊中多種BMP－15基因突變被認為是潛在的導致卵泡發育改變和不孕的因素［3，4］。目前許多研究已經證明GDF－9是控制綿羊高產仔的主效基因之一，Hanrahan等［4］將 Belclare綿羊和 Cambridge綿羊 GDF－9 基因編碼區1184bp處的堿基突變(C→T)命名為G8突變，將BMP－15718處堿基突變718處堿基突變(C→T)命名為B2突變，同時將Belclare綿羊的BMP－15基因1100處的堿基突變(G→T)命名為 B4突變。Hanrahan等［4］發現 X 染色體上 BMP－15基因的突變和5號染色體上GDF－9基因的突變，與高繁殖力綿羊品種Belclare和Cambridge雜合攜帶母羊的高排卵數和純合子不育相關聯。GDF－9在小鼠定位于11號染色體的 29.0cM 處［5］，全長 4618bp，包含兩個外顯子，其中外顯子1的編碼區是397bp，外顯子2的編碼區是926bp，共同編碼一種由441個氨基酸組成的蛋白質，其成熟C－末端片段由135個氨基酸殘基組成，與綿羊的同源性為66%［6］。而 BMP－15定位于 X染色體的2.81 cM，全長6618bp，同樣也是兩個外顯子，其中外顯子1的編碼區是322bp，外顯子2的編碼區是857bp，共同編碼一種由392個氨基酸組成的蛋白質。其特性與GDF9相似。本研究以高繁殖力小鼠(ICR)和低繁殖力小鼠(BALB/c)為實驗材料，研究基因GDF－9和BMP－15在兩種小鼠中的多態性，旨在找出與小鼠高繁殖力相關的SNP，為小鼠高繁殖力的標記輔助選擇和育種提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物

ICR 小鼠，SPF 級(specific－pathogen free，SPF)，雌雄各20只，雌鼠6周齡，雄鼠8周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號【SCXK(京)－2010－0002】。BALB/c 小鼠，SPF 級，雌雄各20只，雌鼠6周齡，雄鼠8周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號【SCXK(京)－2009－0007】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑

全血基因組提取試劑盒、Taq酶、dNTPs(10mM)、DNA Marker2k均購自北京全式金生物技術有限公司;內切酶KpnI、XhoI購自寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;Dual－Luciferase? Reporter Assay System劑盒(Promega公司，美國);Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent(Invitrogen公司，美國);測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 小鼠繁殖

購回實驗動物動物為SPF級別，適應飼養兩周及實驗均在 SPF級動物室進行【SYXK(京)2009－0033】，每一品系雌雄各20只隨機配對，以產仔5胎來計算平均生殖能力，具體統計指標包括產仔數、離乳數和胎間隔時間。

1.3.2 小鼠全血基因組DNA提取

在同一時期對不同組別的每只小鼠進行尾靜脈采血，用EDTA抗凝，并使用全式金基因組試劑盒提取基因組DNA，用去離子水溶解，測濃度和OD值后，瓊脂糖凝膠電泳，保存于－20℃。

1.3.3 引物設計和 PCR擴增

根據 GeneBank發表的 GDF－9(登錄號 NC_000077.6)和 BMP－15(登錄號 NC_000086.7)基因的兩個外顯子的序列設計引物，引物序列及條件退火溫度見表1。PCR反應總體積 25μL，其中 DNA為1μL(約 30ng)，上下游引物終濃度為 200ng/μL，dNTPs為 0.5μL(終濃度為 200nM/μL)，20mM Tris－HCl，pH8.3，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，Taq DNA聚合酶 2.5U。反應條件:97℃預變性 5min，95℃ 變性 30s，65℃ 或者 63℃ 退火 30s，72℃延伸50s，35個循環;最后再 72℃延伸 5min，4℃保存。產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 PCR產物直接測序和分析

PCR產物測序使用的是ABI3730平臺正向或反向測序，測序結果使用 DNAstar和 Chromas軟件分析。

1.3.5 不同基因型的 GDF－9二級結構分析

對存在基因序列位點改變，分別使用 UCL和RNAfold軟件預測位點變化分別對編碼區和非編碼區的二級結構的影響。

表1 擴增基因BMP－15和GDF－9外顯子的引物Tab.1 Oligonucleotide primers for the amplification of the exons of the BMP－15 and GDF－9 exons

1.3.6 GDF－9雙熒光素酶報告基因表達載體的構建

分別以ICR和BALB/c小鼠的全血基因組DNA為模板，擴增目的DNA片段，引物序列如下:

KpnI－F:5'GGGGTACCATGTACAGCTAGGCATG CTTGA 3';

XhoI－R:5'CCCTCGAGTTTCACTGGCTCCACT CTGGGATT 3'。PCR產物用內切酶 KpnI、XhoI進行酶切，酶切產物用天根凝膠回收試劑盒回收，回收的目的片段用 T4連接酶連接到 pGL3－Basic載體上，25℃反應15 min，構建重組質粒;并轉化大腸桿菌DH5α菌株。酶切鑒定后測序驗證。分別取100 μL測序驗證正確的重組質粒加入到50 mL的LB培養基中，37℃、250 r/min轉恒溫晃動培養過夜，然后分別提取質粒DNA。

1.3.7 細胞的培養和轉染

將293T細胞接種到48孔板進行培養，當細胞的密度達到90%時，使用1.3.6中提取的質粒，按照載體pGL3與pRL－TK載體6∶1的比例進行共轉染，脂質體2000作為轉染試劑使用脂質體2000進行共轉染細胞。每組做3個復孔，實驗平行重復3次。

1.3.8 雙熒光素酶活性檢測

轉染48h后用雙熒光素酶檢測試劑盒進行檢測:棄去孔內的培養基，用PBS洗一遍，然后每孔加入65μL的細胞裂解液，室溫緩慢震蕩15 min;加入30μLLARⅡ，檢測螢火蟲熒光素酶活性;再加入30 μL終止反應液，檢測海腎熒光素酶活性。每種基因型一次做3個重復孔，結果表示為相對的熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性)。實驗平行重復3次。

2 結果

2.1 小鼠繁殖5胎的統計學分析

兩種品系小鼠分別記錄5胎繁殖記錄，期間死亡的小鼠按數據缺失計;數據以均數±標準差(±s)表示;組間 t檢驗，p≤0.05為差異有顯著性;使用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，結果見表2。

表2 表2小鼠繁殖的記錄ˉ±s)Tab.2 The mice breeding of record

表2 表2小鼠繁殖的記錄ˉ±s)Tab.2 The mice breeding of record

注:對檢測指標進行同列比較，A表示兩組之間差異極顯著(P＜0.01)，a表示兩組之間差異顯著(P＜0.05).Note:Detect indicators of the same column，A represents the two groups was highly significant(P ＜ 0.01)，the a said between the two groups was significantly different(P ＜0.05)

胎間隔時間(天)a Tire interval ICR 20 5 100 14.25 ± 3.866 12.85 ±4.235 26.68 ± 8.186 BALB/c 20 5 100 5.01 ±2.556 3.80 ±3.012 31.06 ±1組別Group親代數(對)Numbers of P胎數(胎)Tires樣本量(例)Samples產仔數(只)A Litter size離乳數(只)A Weanling number 3.010

2.2 小鼠全血基因組DNA電泳圖

注:泳道1為Marker2000，泳道2、3為 ICR品系;泳道4、5為 BALB/c品系。圖1 小鼠基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Note:Lane 1:D2000Marker;Lanes 2、3:ICR strain;Lanes4、5:BALB/c strain.Fig.1 Electrophoretic pattern of Mouse genome DNA

2.3 PCR產物測序結果

GDF－9在同一品系之間測序結果沒有變化，但在不同品系之間堿基存在差別，在外顯子1的上游非編碼區的第8個堿基處，ICR為 T，BALB/c為 C(圖 2－A、a，彩插 1);外顯子 2 的 490 位 ICR 為 C，BALB/c 為 T(圖 2－B、b，彩插 1)，這不引起氨基酸的變化;746 位 ICR 為 T，BALB/c為 C(圖 2－C、c，彩插1)，該點在ICR為甲硫氨酸，在BALB/C為蘇氨酸。其中甲硫氨酸和蘇氨酸均為極性中性氨基酸，甲硫氨酸是含硫必需氨基酸，為含硫 α－氨基酸之一，是哺乳動物的必需氨基酸和生酮氨基酸。其側鏈易氧化成甲硫氨(亞)砜，在α螺旋結構中更常見。蘇氨酸含有一個醇式羥基的脂肪族α氨基酸，L－蘇氨酸是組成蛋白質的20種氨基酸中的一種，有兩個不對稱碳原子，可以有4種異構體，是哺乳動物的必需氨基酸和生酮氨基酸。BMP－15不論是同一品系還是不同品系、組內或者組間，序列均沒有的變化。

注： 圖 A、B、C 代表 ICR 品系，圖 a、b、c代表 BALB/c品系圖2 GDF-9外顯子測序結果Note: Figure A, B, C, representative of ICR strain, Figure a, b, and c represent the BALB / c strainFig.2 GDF-9 exon sequencing results

2.4 GDF9二級結構預測分析

為了驗證序列變化對非編碼區和編碼區二級結構的影響，我們分別使用RNAfold和UCL在線預測不同基因型的 GDF－9的二級結構。非編區位點變化沒有引起GDF－9二級結構的變化，但對于其結構能量熵有一定的影響，由此可知，該位點變化時對其結構的穩定性有一定的影響。編碼區氨基酸的變化對其二級結構的影響較小，為只有ICR的α螺旋結構比BALB/c稍長(見圖3、4)。

圖3 GDF－9外顯子1上游第8位堿基變化對非編碼區二級結構的影響Fig.3 The eighth base change of the GDF－9 exon 1 impact on non－coding region secondary structure influence

注:左邊為ICR品系，右邊為BALB/c品系。圖4 GDF－9外顯子2序列變化對蛋白二級結構的影響Note:The left is ICR strain，and the right is BALB/c strain.Fig.4 GDF－9 exon 2 sequence change on the influence of protein secondary structure

2.5 載體構建示意圖

我們將有變化的5’UTR連接到 pGL3－Basic載體上，由于Basic載體上沒有啟動子，所以若該區域具有啟動子的功能則下游螢火蟲基因就會表達，構建的載體示意圖見圖5。

2.6 雙熒光素酶相對活性檢測結果:

由雙熒光素酶活性可以看出，BALB/c品系中GDF－9上調下游螢火蟲熒光素酶基因的表達能力比ICR 低 38.4% 左右，P ＜ 0.05(P=0.001)具有統計學差異。可以看出 GDF－9通過非編區影響 GDF－9基因的表達從而對于小鼠的繁殖能力是有一定的作用。

圖5 載體結構示意圖Fig.5 Carrier structure diagram

圖6 雙熒光素酶相對活性檢測Fig.6 Dual luciferaserelative activitydetection

3 討論

3.1 ICR和BALB/c小鼠繁殖能力的比較

本研究之所以選擇一個近交系和一個遠交系品種，是考慮到這兩個品系之間在產仔數目上存在明顯的差別，我們目的就是要研究除了自身品系之間的差別外，在基因水平是否存在能夠區分不同繁殖能力的標記性的SNP位點。對不同品系的小鼠產仔能力進行了比較，與孟瓊等［7］人研究相比，ICR產仔數目較以往有所提高，ICR產仔數目是BALB/c的2.8倍左右。

3.2 GDF-9基因的多態性

與以往的研究相比，本研究是第一次發現了ICR和BALB/c小鼠在 GDF－9中的5’UTR和編碼蛋白成熟區存在多態性位點，5’UTR ICR－T對下游基因的表達起調節作用。在兩種品系小鼠 GDF－9中發現了三個基因多態性位點，一個位于5’端非編碼區 ICR到 BALB/c的堿基變化(T→C)，;另外兩個位于成熟的蛋白編碼區，其中一個引起了氨基酸的變化，另一個是無義變化。但單獨在兩種品系中均沒有檢測到SNP位點。

另外，本研究測序所得的ICR品系小鼠的GDF－9基因第一個外顯子和第二個外顯子與Gene Bank所公布的C57小鼠的基因序列同樣也存在3個堿基的不同，這種差異可能是由于小鼠品系不同造成的。

3.3 GDF-9的不同基因型的二級結構變化

本研究運用分子生物學知識預測了不同基因型的GDF－9的二級結構。對于研究 GDF－9在繁殖中的作用開辟了新途徑，即除了編碼區的作用之外，非編碼區的不同也對基因的功能起一定的調控作用。

3.4 GDF-9和BMP-15基因與繁殖力的關系

GDF－9是通過旁分泌方式對卵泡的生長和分化起重要作用［8］。在小鼠中，除原始卵泡以外的各個時期卵泡的卵母細胞中，GDF－9 mRNA及蛋白持續表達至排卵后，于受精后1.5天消失。利用重組GDF－9蛋白在體外研究證實:GDF－9在卵泡生長和發育的各個階段均有生物學活性并重要作用。

GDF－9在卵泡發育早期階段的重要性在一些哺乳動物中已有得到證實，例如 GDF－9缺陷小鼠［2］、母羊的自發純合突變［4］或免疫接種抵御 GDF－9［9］都表現出阻滯卵泡處于早期階段。McIntosh等通過主動免疫小鼠－為 GDF－9和 BMP－15的前體蛋白對卵母細胞從卵巢分泌出后起重要的監管作用提供了生理學上的證據，包括控制排卵率和產仔數目［10］。在體實驗表明 GDF－9也會造成原始卵泡數量的減少［11］，體外暴露嚙齒類動物［12］和人類［13］的卵巢組織促進了初級卵泡的進程。

我們的研究得到 GDF－9在不同繁殖力的小鼠中，高繁殖力的ICR品系中基因型不同的5’UTR比BALB/c可以更有效的促進 GDF－9的表達，通過雙熒光素酶報告分析可以給我們以下的指示:產仔能力的大小可能與 GDF－9的表達量之間存在劑量依賴作用。這一點AlonKedem等的研究發現，從女性得到的初級卵母細胞對于重組的GDF－9和BMP－15存在劑量依賴的方式，將分離的卵母細胞暴露在這兩種生長因子中可以增加發育中的卵母細胞的數量［14］。同時 Janet和 Kenneth 研究發現 GDF－9 和BMP－15的表達水平比例在每個物種都不相同，這點也支持了GDF－9和BMP－15的mRNA水平的不同是調控排卵率表型的關鍵因素［15］。

3.5 造成BALB/c繁殖能力降低的原因

目前，對于小鼠生殖力研究大多是在生理機制方面展開的，從現有文獻中還沒有看到與基因多態性相關的報道，本研究證明了在ICR和 BALB/c小鼠中GDF－9存在基因多態性位點，該位點與小鼠的繁殖力有密切的關系。影響小鼠繁殖力的因素包括遺傳、環境、營養、管理和疾病等五大因素。然而，在小鼠被生物凈化并在標準化的飼養環境條件下，環境、營養、管理和疾病等因素被嚴格地控制，而遺傳特性則成為影響小鼠繁殖力最本質和內在的重要因素［16］。

其中，近交衰退是影響BALB/c繁殖能力低下的一個主要原因。從遺傳學角度來看主要可以從以下兩方面進行解釋:1.有害的隱性基因的暴露。一般病態的突變基因絕大多數都是隱性的，所以處于雜合狀態時不表現出病態或不利的性狀。這些有害基因的作用可被顯性的雜合子等位基因所掩蓋，但經過一段近親繁殖，純合的基因(純合子)比例漸漸增多，于是有害的隱性基因相遇成為純合子而顯出作用，出現不利性狀，對個體的生長發育、生活和生育等產生明顯的不利影響。2.多基因平衡的破壞。個體的發育受多個基因共同作用的影響，雖然其中每個基因的作用效應微小。對環境適應較好的野生或雜交動物，由于自然選擇的作用有利于保存那些生物適應能力較強的基因組合具有平衡的多基因系統，近交繁殖往往會破壞這個平衡，造成個體發育的不穩定［17］。

目前在環境毒理和人類避孕方面的研究中需要高繁殖力的小鼠，若能找出繁殖力與基因之間的關系，就可以利用提前篩選性培育技術來提高小鼠的生產繁殖效率，提高實驗動物的經濟效益，也可以為篩選相關的模型動物種群提供幫助。本研究發現了GDF－9在繁殖能力不同的品系小鼠 ICR和BALB/c中的多態性，為篩選相關的模型動物種群提供參考資料。

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