基于微衛星DNA標記的恒河猴遺傳多樣性研究

禹文海，和占龍，魯紹雄，魯帥堯，趙 遠，楊鳳梅，李艷艷，陳麗雄，王俊斌，沈 冬

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院 醫學生物學研究所，昆明 650118;2.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201)

微衛星DNA(microsatellite DNA)，也稱為簡單序列重復(simple sequence repeat，SSR)、短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)，在生物基因組中一般以1～6個堿基為其核心序列、首尾相連組成串聯核苷酸重復序列。由于核心序列重復數目的不同，產生了DNA多態性。微衛星DNA標記與其它分子標記相比，具有數量多、分布廣、多態性豐富、共顯性遺傳、選擇中性、易檢測、重復性好、可提供高分辨率的遺傳信息等特點，是一種理想的分子標記，已廣泛應用于群體遺傳結構研究和遺傳多樣性分析［1－5］。恒 河 猴 (Macaca mulatta)，為 靈 長 目(Primates)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬的一個種，是非人靈長類中分布范圍最廣、數量最多的一個類群。國內外通過人工馴養繁殖，已建立了許多人工飼養繁殖種群，被廣泛地應用到醫學和生物學等研究領域。中國醫學科學院醫學生物學研究所全國醫學靈長類研究中心開展人工飼養、馴化繁殖恒河猴已有50多年的歷史，本研究從該中心人工飼養繁殖的2000余只恒河猴群體中隨機抽取60只，利用19個微衛星DNA標記對該恒河猴群體進行遺傳多樣性檢測，以期獲得現有實驗恒河猴種群的遺傳概貌信息及建立一種對恒河猴群體有效的遺傳監測方法，并對現有繁育方式作出評價，從分子遺傳角度指導該恒河猴群體今后開展合理、科學的遺傳繁育。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和基因組DNA提取

隨機抽取人工飼養繁殖的普通級恒河猴共60只，雌雄各半，來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所全國醫學靈長類研究中心【實驗動物生產許可證:(滇)SCXK2010—0006】。股靜脈抽取全血2 mL，EDTA抗凝。采用 AXYGEN DNA提取試劑盒提取基因組DNA，詳細操作步驟見說明書。

1.2 主要試劑和儀器

PCR 儀(BIO－RAD 公司，美國)，垂直電泳槽、電泳儀和凝膠成像系統(北京六一儀器廠，中國);Sony數碼相機(Sony公司，日本)。DNA提取試劑盒(愛思進生物技術有限公司，中國)，2×PCR Master Mix、DL2000及聚丙烯酰胺凝膠電泳相關試劑(天根生化科技有限公司，中國)。

1.3 引物設計及PCR擴增

自 NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists)查取19個微衛星 DNA標記，由生工生物工程(上海)有限公司合成，各微衛星標記在染色體上的分布等信息見表1。

PCR反應體積為 25 μL，引物 F和 R各(20 μM/L)1 μL，模板 DNA 1 μL，2 × PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應條件為 95 ℃ 預變性6 min;然后94℃變性1 min，54℃ ～65℃退火45 s，72℃延伸 1 min，35個循環;最后 72℃延伸10 min;4℃終止反應。

1.4 電泳及結果記錄

PCR擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測效果后，取4 μL與上樣緩沖液混合后在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上60V電泳16h，硝酸銀染色后用氫氧化鈉顯色，條帶清晰后用10%的乙酸終止，最后用凝膠成像系統和Sony數碼相機雙重照相。

1.5 統計分析

用BioRad凝膠成像系統對8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖帶進行分析，確定其核苷酸條帶分子量大小，以大小不同的擴增片段為不同的等位基因，按等位基因從小到大的順序分別依次定名為A、B、C、D、E、F 等。用 POPGENE Version 1.32 軟件計算出各座位的觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、等位基因頻率(gene frequency)、觀察等位基因數(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(effective number of alleles，Ne)、香 隆 信 息 指 數(shannon’s information index，I)等指標，并根據Botstein等的公式利用 Excel計算多態信息含量(polymorphism information content，PIC)。

使用 POPGENE Version 1.32軟件對各座位進行連鎖分析，根據座位等位基因的數目多少，應用完全計數或馬爾科夫鏈法檢驗群體的 Hardy－Weinberg遺傳平衡狀態。

表1 微衛星DNA標記的相關信息Tab.1 The information ofmicrosatelliteDNA markers

2 結果

2.1 PCR擴增結果檢測

對19個微衛星座位的PCR擴增產物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，本文以D4S1645座位的電泳圖譜為例說明(圖1)。

注:M:DL2000 DNA分子量標準，1～22:樣品編號。圖1 D4S1645座位PCR擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果Note:M:DL2000 DNA marker，1 ～22:Number of samples.Fig.1 The PAGE image of PCR products at D4S1645 locus

2.2 群體遺傳多樣性分析

根據各微衛星座位的基因型，計算出各座位觀察等位基因數及其頻率、有效等位基因數、觀察雜合度，結果見表2。19個微衛星座位均呈現出了多態性，共檢測到了觀察等位基因164個。各座位的觀察等位基因數在6～11個之間，平均為8.6316個。各基因座位的有效等位基因數在 3.5727 ～8.9416個之間，平均為6.0709個。觀察等位基因數最多的座位是 D4S1645、D5S1470和 D13S894，有11個等位基因;觀察等位基因數最少的座位是D19S210和D16S3106，有6個等位基因。

表2 恒河猴群體19個微衛星座位的等位基因信息Tab.2 Allele information at 19 microsatellite loci of Macaca mulatta population

表3 恒河猴群體19個微衛星座位的遺傳多態性Tab.3 The genetic diversity measured at 19 microsatellite loci of Macaca mulatta population

利用POPGENE version 1.32軟件計算出各微衛星座位的觀察雜合度、期望雜合度、香隆信息指數等指標，結果見表3。各個微衛星座位的觀察雜合度在0.2560 ～ 0.6364 之間，群體平均值為 0.4309，其中，D5S1470座位最高，D19S210座位最低;期望雜合度在 0.7230 ～ 0.9010 之間，群體平均值 為 0.8270，D13S894座位最高，D16S3106座位最低;多態信息含量在 0.6771 ～ 0.8874 之間，群體平均值為 0.7979，D3S1768座位最高，D16S3106座位最低;香隆信息指數在 1.4249 ～ 2.2662 之間，群體平均值為 1.8901，D5S1470座位最高，D16S3106座位最低。

采用 POPGENE version 1.32軟件計算恒河猴群體每個微衛星座位Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗的精確P值，結果顯示，本研究檢測的19個微衛星座位均偏離 Hardy－Weinberg平衡(P ＜0.01)。

3 討論

群體的遺傳多樣性通常用多個基因座位遺傳多樣性參數的平均值來描述，其重要指標主要有群體平均等位基因數、平均有效等位基因數、平均觀察雜合度、平均期望雜合度、平均多態信息含量等［6］。本實驗中各微衛星座位的觀察等位基因數平均為8.6316個;有效等位基因數平均為6.0709個;多態信息含量平均值為0.7979，各微衛星座位多態信息含量均大于0.5，均屬于高度多態性座位(當PIC＞0.5時，為高度多態性座位);各個微衛星座位的觀察雜合度群體平均值為0.4309;期望雜合度群體平均值為0.8270。由此可見，本實驗所研究恒河猴群體等位基因數多、多態信息含量高、雜合度大，說明群體內基因型一致性差，遺傳變異大，遺傳多樣性豐富。所研究恒河猴群體有如此豐富的遺傳多樣性，追溯原因有以下兩點:一是恒河猴群體遺傳基礎廣泛，他們的祖先來源于云南的鎮沅、景東、楚雄、保山等多個地區;二是多年來開展的遺傳繁育方式較合理，避免了近交系數的上升。

本研究檢測的19個微衛星座位均偏離Hardy－Weinberg平衡(P＜0.01)，說明本研究檢驗的恒河猴群體存在雜合子缺失的現象。打破平衡的因素有突變、選擇、隨機遺傳漂變、遷移和遺傳異質性等，本研究19個微衛星座位均處于 Hardy－Weinberg不平衡狀態，主要原因可能是群體處于非隨機交配體制中，存在一定程度的人工選擇。

微衛星DNA標記技術已在近交系大小鼠遺傳監測、親子鑒定及法醫鑒定中得到了有效的應用［7－10］。本研究從大量的微衛星DNA座位中選擇分布在不同染色體上的19個微衛星標記，利用這些微衛星引物對隨機抽取的60只人工飼養繁殖的恒河猴個體進行PCR擴增，結果顯示各微衛星座位均能夠擴增出目的條帶，電泳條帶清楚可辨，呈現明顯的DNA多態性，說明所選擇的微衛星標記具有一定的代表性，能反映出個體間的遺傳概貌，可以有效的進行恒河猴群的遺傳質量監測。但本研究中樣品較少，不足以完全反映出群體的遺傳多樣性，有必要進一步擴大樣本量，并對實驗方法進一步完善，建立標準的恒河猴遺傳監測分子生物學方法，定時監測恒河猴群體遺傳多樣性狀況，了解群體遺傳多樣性的變化趨勢，從而指導人們進行合理的恒河猴遺傳資源保護和利用。

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