小鼠組蛋白去乙酰化酶2多肽抗血清的制備

朱 華，梁 良，盛樹力，黃 瀾，徐艷峰，秦 川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

阿爾茨海默病(AD)是癡呆的主要類型，臨床表現(xiàn)為記憶和認(rèn)知的退化，其主要病理特征是胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和胞外淀粉樣蛋白沉淀形成老年斑(SP)。AD的致病機(jī)理仍不明確，目前比較流行的學(xué)說是 β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說［1］。表觀遺傳學(xué)修飾為研究AD開辟了新的途徑，其中最受關(guān)注的是 DNA 甲基化和組蛋白修飾［2，3］，組蛋白酰基化狀態(tài)由組蛋白乙酰化酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)催化，組蛋白酰基化修飾在學(xué)習(xí)和記憶功能中的作用如何?在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)無論是在細(xì)胞水平還是在整體水平，都需要大量HDAC的抗體來進(jìn)行檢測(cè)。本文采用合成肽制備HDAC2抗血清，檢測(cè)了其特異性和在AD小鼠腦組織中的應(yīng)用效果，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 多肽片段的挑選、合成

根據(jù) Genbank中小鼠 HDAC2的氨基酸序列(Genbank accession number:BC031055)，挑選 392～411位氨基酸位多肽為抗原 (N'-EDSGDEDGREDPDK RISIRY-C')(圖1)。多肽片段由北京中科亞光生物科技有限公司合成。純度99%。

1.2 多肽片段與鑰孔戚血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)的偶聯(lián)

稱取12 mg多肽，用0.5 mL pH 7.4的 PBS溶解，緩慢加入10 mL KLH(Sigma，貨號(hào)H8283)中，量取事先配好的聯(lián)苯胺-亞硝酸鹽混合物350 mL冰浴冷卻下緩慢滴加上述KLH-多肽混合物中，冰浴反應(yīng)1.5 h時(shí)。置入透析袋，PEG 6000濃縮至 2 mL。Sephadex G-200經(jīng)水飽和后裝柱，0.05 mol/L磷酸緩沖液 (pH 7.2)平衡，緩慢上樣，在280 nm監(jiān)測(cè)下收集第一個(gè)峰。

圖1 HDAC2氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of histone deacetylase 2

1.3 免疫動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔1只，購自中國藥品生物制品檢定所動(dòng)物中心【SCXK(京)11-00-0010】，體重約3 kg。實(shí)驗(yàn)在本所進(jìn)行【SYXK(京)2010—0030】。取1 mL偶聯(lián)好的多肽加等量弗氏完全佐劑(Sigma，貨號(hào) F5506)，充分乳化后在動(dòng)物背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每只2 mL。以后每隔3周用弗氏不完全佐劑(Sigma，貨號(hào)056K8908)與多肽乳化后免疫動(dòng)物，共3次。第3次免疫后10 d，動(dòng)脈放血，分離血清，－80℃保存。

1.4 ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

第2次免疫后10 d，耳緣靜脈取血，3 000 r/min 10 min離心分離血清檢測(cè)抗體效價(jià)。以2 μg/mL的多肽為抗原4℃過夜包被酶標(biāo)板。第2天用PBS沖洗，分別加入免疫血清(一抗)和酶標(biāo)羊抗兔IgG(北京鼎國生物技術(shù)公司，貨號(hào)EIA-0011)。具體方法見文獻(xiàn)［4］，顯色后在 Bio-Rad 3350自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取450 nm光密度值。

1.5 Western-blot

按照文獻(xiàn)［5］的方法從小鼠腦組織中提取HDAC2蛋白，將樣品濃度調(diào)整至1.5 μg/μL。與同濃度的偶聯(lián)多肽進(jìn)行10%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)。把NC膜放人封閉液中，搖床上溫育l h。TBS漂洗后，分別轉(zhuǎn)移到1:1000稀釋的市售 HDAC2抗體(abcam公司，貨號(hào) ab51832)，室溫下振蕩孵育2 h，TBS-T漂洗4次，每次10 min;加入1:10 000 TBS-T稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗溶液，室溫下振蕩孵育1 h;TBS-T漂洗4次，每次10 min;加入酶反應(yīng)底物TMB，反應(yīng)終止后曝光、顯影、定影、照相。

1.6 免疫組化

App/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織常規(guī)脫蠟至水進(jìn)行SP法免疫組化染色:3%過氧化氫溶液作用15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶;用pH 6.0枸櫞酸微波修復(fù)10 min，加正常山羊血清室溫孵育30 min，甩去多余血清，滴加免疫血清做為一抗(稀釋度1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600)。陰性對(duì)照用0.01 mmol/L的 PBS，4℃過夜，滴加生物素化二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物，北京中杉金橋，貨號(hào) PV-9002)，37℃ 30 min，DAB 顯色(北京中杉金橋，貨號(hào) ZLI-0001)，(5～10)min后 PBS終止，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 抗體效價(jià)

為了鑒定所制備的動(dòng)物免疫血清的效價(jià)和是否具有識(shí)別小鼠去組蛋白乙酰化酶的能力，我們用ELISA方法，以合成的小鼠HDAC2多肽為抗原包被酶標(biāo)板，抗體稀釋到1∶4 000時(shí)的吸光值遠(yuǎn)高于對(duì)照抗原BSA的吸光值(樣品孔與對(duì)照L吸光值之比高于3，P/N≥3)，表明抗體與小鼠 HDAC2的免疫反應(yīng)為陽性，而且所得到的抗體是特異性的抗體(表1)。

表1 不同稀釋度的HDAC2多肽抗體的ELISA結(jié)果Tab.1 ELISA results of HDAC2 antibody at different dilutions

2.2 Western blot結(jié)果

為了進(jìn)一步確定所制備的免疫血清與HDAC2免疫反應(yīng)的特異性，我們用合成的多肽抗原與免疫血清進(jìn)行Western blot，并與市售抗體進(jìn)行比較。圖2顯示，合成多肽可以同不同稀釋度的免疫血清形成反應(yīng)顯示帶(第 1、2、3、4 行)，(第 1 行)。這些結(jié)果提示我們所制備的免疫血清可以識(shí)別小鼠的HDAC2。

1.1∶1 000稀釋的HDAC2合成多肽與抗血清反應(yīng)。2.1∶2 000稀釋的HDAC2合成多肽與抗血清反應(yīng)。3.4 APP/PS1小鼠腦組織與抗血清反應(yīng)。5.1∶1 000稀釋的HDAC2多肽與市售抗體反應(yīng)。6.APP/PS1小鼠腦組織與市售抗體反應(yīng)。圖2 小鼠HDAC2多肽抗血清、市售抗體與合成多肽及小鼠腦組織的Western blot結(jié)果Lane 1:Synthesized HDAC2 reacts with antisera in 1∶1 000.Lane 2:Synthesized HDAC2 reacts with antisera in 1∶2 000.Lane 3＆4:APP/PS1 mice brain tissue reacts with the antisera.Lane5:Synthesized HDAC2 reacts with the commercial monoclonal antibody.Lane6:APP/PS1 mouse brain tissues react with commercial monoclonal antibody.Fig.2 Western blot assay of the antiserum，HDAC2 antibody with the synthesized HDAC2 peptide in the APP/PS1 mice brain tissue(Protein standards are shown on the left).

2.3 免疫組化結(jié)果

免疫血清在 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 四個(gè)稀釋度均能與APP/PS1小鼠腦組織中的HDAC2反應(yīng):大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)陽性著色，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)未見陽性著色。海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)陽性著色，間質(zhì)內(nèi)未見陽性著色。1∶1 600及陰性對(duì)照未見陽性顆粒。隨著稀釋度的增高，染色的背景降低(圖3見封二)。

3 討論

組蛋白去乙酰化酶2是Siauins家族中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的去乙酰化酶之一。其生理功能是除去乙酰基。改變蛋白質(zhì)的性能，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)。組蛋白酰基化狀態(tài)由組蛋白乙酰化酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶催化，越來越多的證據(jù)顯示組蛋白酰基化修飾在學(xué)習(xí)和記憶功能中起了重要作用［6，7］研究發(fā)現(xiàn) HDAC不僅具有神經(jīng)保護(hù)的作用，同時(shí)能增強(qiáng)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力，因而HDAC作為其催化靶點(diǎn)越來越引起重視。研究組蛋白去乙酰化酶在AD的作用機(jī)制，為研究AD提供了新的靶點(diǎn)。組蛋白去乙酰化酶作為主要靶蛋白在其中所起作用為:(1)改變組蛋白酰基化水平進(jìn)而影響與記憶相關(guān)基因的表達(dá);(2)參與了AD的發(fā)病過程。HDAC2作為組蛋白去乙酰化酶家族成員之一，在AD中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)在AD鼠中出現(xiàn)組蛋白酰基化水平異常［8，9］，而組蛋白去乙酰化酶抑制劑能改善 AD鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力并提高組蛋白酰基化。App/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前公認(rèn)的研究AD的最佳模型，此模型鼠在6個(gè)月時(shí)大腦皮質(zhì)即出現(xiàn)老年斑［10］。且出現(xiàn)神經(jīng)潰變和突觸丟失等形態(tài)學(xué)變化并伴有學(xué)習(xí)記憶能力下降等功能障礙。我們的多肽血清可以特異識(shí)別App/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的HDAC2，效價(jià)達(dá)到1:800。可應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病、腫瘤等 HDAC2的體內(nèi)、體外研究。

要制備出理想的抗體，首先要有較純的、抗原性良好的免疫原;其次是選擇一個(gè)合適的免疫途徑。小鼠的HDAC2序列含有478個(gè)氨基酸，其392-411位氨基酸位因親水性較高，沒有易發(fā)生折疊的半胱氨酸，末端不含影響免疫原性的芳香族氨基酸等優(yōu)勢(shì)被本實(shí)驗(yàn)選為多肽抗原。化學(xué)合成的多肽作為抗原沒有免疫原性，需要偶聯(lián)到一個(gè)具有免疫原性的載體蛋白上，將偶聯(lián)物作為抗原免疫動(dòng)物。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、卵蛋白(OVA)和鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)，其中鑰孔戚血藍(lán)蛋白來自于軟體動(dòng)物，其序列與哺乳動(dòng)物同源性很小，而且該蛋白分子量較大，抗原性非常強(qiáng)，是目前多肽抗體制備中應(yīng)用最為廣泛的載體蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KLH偶聯(lián)的HDAC2多肽血清可與免疫原特異性反應(yīng)，并與異常表達(dá)HDAC2組織發(fā)生反應(yīng)，說明多肽段的選擇、偶聯(lián)策略是正確的，可以應(yīng)用于抗血清的大量制備。

我們制備抗多肽血清未經(jīng)過純化，除多肽抗體成分外還含有其它雜蛋白如血清中非抗體成分白蛋白、免疫多肽無關(guān)的抗體成分等。這可能也是Western blot結(jié)果中在43～55Kd間出現(xiàn)雜帶的原因。推測(cè)低稀釋度的免疫組化染色背景較重也與此相關(guān)，可通過提高抗體稀釋度的方法避免。

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