超聲在評價大鼠酒精性脂肪肝模型中的應用

李曉娟，張大鹍，隋麗華，白冰珂，李瑞生

(1.解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039;2.解放軍第302醫院醫學影像中心，北京 100039;3.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)［1］是一種由于長期過度飲酒引起的中毒性肝臟疾病。其中酒精性脂肪肝屬于一種可逆轉的良性肝臟疾患，但若不及時治療則可向酒精性肝炎、肝硬化進展［2］。研究表明平均每年約有12%的酒精性脂肪肝患者轉變成肝硬化［3］。雖然國內外已經對酒精性脂肪肝的發病機制進行了大量的研究，但其發病機制及病理過程尚不完全清楚，因此建立可重復、簡單易行且穩定的動物模型顯得尤為重要。目前臨床上公認的脂肪肝診斷的金標準是肝穿刺病理學診斷，但由于其具有創傷性，很難作為臨床和篩查的有效方法［4］。而體外超聲具有無創傷、操作簡便、可控性好等優點，可以作為診斷和篩查酒精性脂肪肝的有效方法。本實驗通過酒精灌胃來建立SD大鼠酒精性脂肪肝模型，利用超聲技術來實時監測造模進展，成模后取肝組織進行病理學模型鑒定，旨在建立一種簡單易行、穩定可靠、實時監控的大鼠酒精性脂肪肝模型的鑒定方法，為今后研究酒精性脂肪肝的發病機制以及藥物治療提供了良好的模型動物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物選擇軍事醫學科學院實驗動物中心SPF級SD大鼠40只，雄性，單鼠體質量190～200 g，實驗動物生產許可證【SCXK(軍)2007—004】;本實驗室具有SPF級實驗動物使用許可證【SYXK(軍)2007—010】。

1.2 試劑及飼料

乙醇(分析純，純度 ＞99.7%)，北京化工廠(批號:20120201);生理鹽水來自解放軍第302醫院制劑室;大鼠飼料由軍事醫學科學院實驗動物中心飼料室提供。

1.3 動物分組及模型制備

SD大鼠在本中心SPF級屏障環境飼養，動物自由飲水、采食正常飼料，1周后隨機分為兩組:正常對照組(n=20)和模型組(n=20)。模型組造模方法:按每周測定的體重計算劑量(10 g/kg)，每日早晚各1次乙醇灌胃，2次灌胃時間需間隔8 h。第1周乙醇灌胃濃度為40%，第2和3周分別遞增為45%和50%，第4周開始乙醇濃度為55%持續灌胃直至12周(2次/d)，而正常對照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.4 大鼠肝臟超聲監測

造模后第4、8和12周分別對模型組和對照組大鼠進行超聲監測。方法是采用速眠新(0.5 mL/kg)將SD大鼠麻醉后仰臥，固定四肢，腹部被皮，涂上耦合劑進行超聲監測，在肋間橫切面分別測量大鼠的肝左葉厚度及左葉長度。診斷脂肪肝的超聲標準為［5］:①肝區近場彌漫性點狀高回聲，回聲強度高于脾臟和腎臟，少數表現為灶性高回聲;②遠場回聲衰減，光點稀疏;③肝內管道結構顯示不清;④肝臟可輕至中度腫大，肝前緣變鈍。根據超聲圖像檢測結果進行對比，以分析酒精性脂肪肝模型的動態發展進程。

1.5 大鼠肝臟病理學檢查

每次超聲監測后從模型組和對照組動物中各選取3只大鼠，處死后采其肝臟組織。12周后兩組剩余大鼠全部采其肝臟組織，于4%甲醛溶液中固定，常規脫水、石蠟包埋、切片和HE染色，光學顯微鏡下行組織形態學觀察，以確診酒精性脂肪肝模型的病理學變化。

1.6 分析超聲與病理檢查結果的關系

將第4、8和12周模型組與對照組動物的超聲影像結果與同期病理學診斷結果進行對應分析，以確定超聲與病理檢查結果是否具有一致性。

2 結果

2.1 肝臟超聲檢查結果分析

第4、8和12周時超聲檢查對照組大鼠肝臟均出現包膜光滑，顯影清晰，肝臟實質回聲稍低，分布均勻，肝臟與腎臟對比明顯，無脂肪變性。而模型組大鼠第4周時肝臟比對照組大鼠的超聲圖像表現為近場回聲稍增強，遠場衰減不明顯，顯示稍有脂肪變性。第8周時肝臟腫大，肝前緣變鈍，可見條狀、線狀中強回聲，門脈管壁回聲增強，聲像圖表現近場回聲增強，遠場明顯衰減，提示已有脂肪病變。而至12周時肝臟脂肪病變更加明顯，提示酒精性脂肪肝模型已造模成功，14只大鼠有12只成模，死亡2只。在造模過程中其肝臟實質回聲逐漸增強，與腎臟回聲的對比逐漸變得不明顯，甚至肝臟回聲高于腎臟回聲(圖1)。

注:A:對照組第4周超聲圖;B:模型組第4周超聲圖;C:模型組第8周超聲圖;D:模型組第12周超聲圖;L:肝臟;K:腎臟。圖1 不同時期超聲監測結果Note:A:Ultrasonogram of a control rat at the forth week;B:Ultrasonogram of a model rat at the forth week;C:Ultrasonogram of a model rat at the eighth week;D:Ultrasonogram of a model rat at the twelfth week;L:Liver;K:Kidney.Fig.1 Results of ultrasound observation in different periods

表1 兩組不同周齡肝組織超聲與病理檢測結果對比分析Tab.1 Comparative analysis of the results of ultrasonic and pathological examination at different weeks between the control and model groups

2.2 肝臟病理學檢查結果分析

對照組大鼠第4、8周時肝組織病理學分析無脂肪病變，第12周時偶見有散在脂肪滴。模型組大鼠第4周時肝組織出現少量圓形空泡，略有脂肪病變。第8周時脂肪變性的肝細胞明顯增多，匯管區域出現炎癥細胞浸潤，顯示為輕度脂肪肝。第12周時肝小葉輪廓出現模糊，肝細胞體積變大，細胞漿內有大量大小不等的圓形空泡，匯管區伴有大量炎性細胞浸潤，脂肪變性的肝細胞占大部分，呈現重度脂肪病變(圖2見封二)。

2.3 肝組織超聲與病理檢查結果對比分析

對照組和模型組大鼠第4、8、12周時肝組織的超聲監測結果與對應同組同期大鼠肝組織病理切片檢測結果對比分析顯示:超聲可以監測到模型組大鼠肝臟脂肪病變從輕度到重度的演變過程以及對照組大鼠無脂肪病變過程，且與肝組織的病理學診斷結果相一致(表1)。

3 討論

體內攝入的酒精主要是在肝臟中進行分解代謝，馬曉茜等［6］研究證實長期大量飲酒有10% ～20%可發生不同程度的酒精性肝病。為了了解酒精性脂肪肝的發病原因研究者建立了許多動物模型來研究其發病機制，Tsukamoto H等［7］利用胃造瘺持續給Tsukamata－French大鼠注入含乙醇的液體飼料方法建立了ALD動物模型，但由于其手術操作復雜，價格昂貴，限制了其推廣應用。古賽等［8］建立了大鼠慢性酒精性脂肪肝動物模型，符合人類的飲酒方式，避免了大鼠對酒精的排斥性，并且可以維持酒精在血液中的高濃度，與人類發病過程比較相似。劉莉等［9］利用 Wistar大鼠證實了茶多酚通過抑制酒精性肝病核因子 κB和環氧合酶2表達水平，對肝損傷起到了一定的保護作用。薛曉偉等［10］實驗證實了槲芪散對小鼠的酒精性肝損傷也具有一定的干預作用。Song BJ 等［11］、李巍等［12］、樓琦等［13］對酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝的發病機制、病理學觀察及疾病預防等進行了深入的探討與分析。

目前實驗室診斷脂肪肝的標準是肝穿刺病理學檢測，但由于其具有一定的創傷性和動物福利的制約受到了限制。因此，本實驗通過酒精性脂肪肝動物模型來研究超聲檢查技術在動物脂肪肝診斷方面的應用。劉云霞等［14］認為增強CT難以區分輕度脂肪肝和正常脂肪肝;而超聲診斷脂肪肝的靈敏度、特異性和安全性較高，該方法方便、經濟、快速、無創等優點已在人脂肪肝診斷中得到了大量的驗證［15］。實驗通過酒精灌胃的方法持續12周來建立大鼠酒精性脂肪肝模型，在造模過程中利用超聲技術來實時監測:模型組4周時肝臟脂肪變性不明顯;8周時形成輕度脂肪肝，12周時已出現了明顯的脂肪變性，在整個造模過程中顯示脂肪病變從無到有，可動態地觀察到酒精性脂肪肝形成的漸變過程，而對照組動物均無脂肪病變。為了驗證其診斷的準確性，分別對模型組和空白組4、8和12周大鼠進行了病理學分析，模型組4周時肝細胞內脂肪滴少，8周時肝細胞中脂肪滴逐漸增多，至12周時已出現典型的脂肪變性，提示造模成功。這與超聲診斷結果具有一致性，說明了超聲檢測技術可以對大鼠酒精性脂肪肝病變進行有效地監測。

總之，本實驗利用超聲技術來實時監測酒精灌胃法造模進展，成功地建立了大鼠酒精性脂肪肝動物模型，并利用病理學方法驗證了其檢測結果的準確性和可靠性，從而證實了超聲技術能夠很好的反映出脂肪肝的動態變化進程，該方法對酒精性脂肪肝造模過程可以進行實時監控，方便快捷，避免了在造模過程中對活體動物采樣所造成的損傷以及處死動物進行病理學檢測等缺點，影響了模型的進一步研究。該技術的應用為今后酒精性脂肪肝動物模型的建立提供了一種更方便的鑒定方法，同時也為進一步研究酒精性脂肪肝動物模型的發病機制和藥物篩選提供了保障。

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