復方庚酸炔諾酮注射液中苯甲醛含量與茶油酸值、過氧化值的相關性研究Δ

彭 茗，任飛亮，朱瀛華，楊永健（上海市食品藥品檢驗所，上海 201203）

復方庚酸炔諾酮注射液（Compound norethisterone enanthate injection，CNEI）為庚酸炔諾酮和戊酸雌二醇的滅菌油溶液，肌肉注射后可逐步釋藥而發揮長效避孕作用，規格為每1 ml中含庚酸炔諾酮50 mg、戊酸雌二醇5 mg。本注射液的主要輔料為茶油，體積分數占輔料總量的58%（V/V），因此茶油的質量對本品的質量至關重要。茶油為山茶科植物油茶Camellia oleifera Abel或小葉油茶Camellia meiocarpa Hu ms.的成熟種子用壓榨法得到的脂肪油，收載于2010年版《中國藥典》（一部）[1]。筆者曾參照2010年版《中國藥典》（二部）[2]所收載的大豆油中脂肪酸組成的分析方法，對CNEI中的輔料茶油采用氣相色譜-質譜（GC-MS）法進行定性檢測，結果證明其主要化學成分為油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸；再采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GC-FID）法進行定量測定，結果油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸分別占約占茶油質量的72%～75%、8.0%～8.3%、6.8%～7.8%和1.9%～2.1%（m/m），4種脂肪酸總和占茶油質量的90%（m/m）以上，與文獻[3]報道基本一致。由于茶油中含大量的不飽和脂肪酸，而注射用油在生產過程中又要經過高溫滅菌的過程，因此容易發生酸敗，生成游離脂肪酸、過氧化物和低分子醛類（如苯甲醛）、酮類等有毒物質[4]。酸值和過氧化值是測定酸敗度的重要指標，本文對4批不同批號的CNEI進行測定，結果表明CNEI中苯甲醛的含量分別與其酸值和過氧化值呈顯著性正相關。

1 材料

BP211D電子分析天平（德國Sartorius股份有限公司，精度:0.01 mg）；OriginPro 8統計軟件（美國Origin Lab公司）；6890型氣相色譜儀（美國Agilent公司）；DB-WAX型毛細管色譜柱（美國J&W公司）。

CNEI（批號:080502、080503、100701、100901，規格:每 1 ml中含庚酸炔諾酮50 mg、戊酸雌二醇5 mg）、庚酸炔諾酮原料藥（批號:100103）、戊酸雌二醇原料藥（批號:090307）和輔料苯甲醇（批號:11398-10-09-01）、茶油（批號:11313-11-05-11）、苯甲酸芐酯（批號:11441-10-03-1）均由浙江仙琚制藥股份有限公司提供，均為分析純，除茶油外，各原、輔料的純度均在99.0%以上；碘化鉀、乙醚、三氯甲烷和冰醋酸均為分析純；苯甲醛和N，N-二甲基乙酰胺（DMA）均為色譜純；氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）和硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）均為上海市食品藥品檢驗所標化。

2 方法

2.1 酸值測定方法

參照2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅨN的酸值測定方法進行測定。取CNEI樣品約5 g，精密稱定，置于250 ml錐形瓶中，加中性乙醇-乙醚（1∶1）50 ml，振搖使完全溶解，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，至粉紅色持續30 s不褪色。另分別取處方量的原、輔料，同法測定。按照以下公式計算酸值:供試品的酸值＝A×5.61/m。式中，A:消耗氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）的容積（ml）；m:供試品的質量（g）。

2.2 過氧化值測定方法

參照2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅨP的過氧化值測定方法。取CNEI樣品約5 g，精密稱定，置于250 ml干燥碘瓶中，加三氯甲烷-冰醋酸（1∶1）混合溶液30 ml，使溶解。精密加新制碘化鉀飽和溶液1 ml，密塞，輕輕振搖0.5 min，在暗處放置3 min，加水100 ml，用硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定至溶液呈淺黃色，加淀粉指示液1 ml，繼續滴定至藍色消失；同時做空白試驗。另分別取處方量的原、輔料，同法測定。按照以下公式計算過氧化值:供試品的過氧化值＝[（A－B）×0.001269/m]×100%。式中，A:消耗的硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）的容積（ml）；B:空白試驗消耗的容積（ml）；m:供試品的質量（g）。

2.3 苯甲醛測定方法

取CNEI 0.25～2.5 g（視樣品中苯甲醛含量調整取樣量），精密稱定，置于10 ml量瓶中，加DMA溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密稱取苯甲醛對照品適量，加DMA定量稀釋制成每1 ml中分別含0.005、0.01、0.025、0.05、0.1 mg的溶液，作為對照品溶液（1）～（5）。照氣相色譜法，用DB-WAX型毛細管色譜柱，進樣口溫度為200℃，分流比為10∶1，FID檢測器溫度為300℃，柱壓保持在5.0 psi，初始柱溫為50℃，以10℃/min的升溫速率升至220℃，保持35 min。分別精密量取供試品溶液和對照品溶液（1）～（5）各1 μl，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按標準曲線法以峰面積計算，即得。

3 結果與分析

3.1 酸值

4批CNEI的酸值測定結果見表1。

表1 4批CNEI的酸值和過氧化值測定結果Tab 1 Acid values and peroxide values of 4 batches of CNEI

CNEI的輔料包括茶油、苯甲醇和苯甲酸芐酯，其中茶油收載于2010年版《中國藥典》（一部），酸值限度為3；苯甲醇收載于2010年版《中國藥典》（二部），酸值限度為0.3；苯甲酸芐酯未被《中國藥典》收載，且在各國外藥典中均無酸值的檢查項，因此可忽略不計。另根據2個主藥的酸值滴定結果，發現其對酸值均無貢獻。根據2010年版《中國藥典》，酸值系指中和脂肪、脂肪油或其他類似物質1 g中含有的游離脂肪酸所需氫氧化鉀的質量（mg），因此可以將各輔料占處方總質量的比例作為權重系數，分別乘以各輔料相應的酸值限度，計算出綜合酸值的限度。由于茶油和苯甲醇分別占處方總質量的50%（m/m）和2%（m/m），則得出綜合酸值限度應為3×50%+0.3×2%≈1.50。可見，4批樣品的酸值均未超出限度，但2008年生產的樣品的酸值約為2010年生產的樣品的1.5～1.7倍，證明本品隨著貯存時間的延長，有游離脂肪酸形成。

3.2 過氧化值

4批CNEI的過氧化值測定結果見表1。

2010年版《中國藥典》（一部）中的過氧化值系指油脂中過氧化物與碘化鉀作用生成游離碘的百分數。2010年版《中國藥典》（二部）中過氧化值系指每1000 g供試品中含有的其氧化能力與一定量的氧相當的過氧化物量，測定步驟與一部略有不同，但基本原理一致。其計算公式與一部有所不同，計算公式為（式中A、B和m的含義均同“2.2”項下）:供試品的過氧化值＝（A－B）×10/m。

該計算方法在國家標準GB/T 5538-1995《油脂過氧化值》中也有所采用。為使前后統一、便于比較，在本文中均將過氧化值換算為2010年版《中國藥典》（一部）的計算公式。在2010年版《中國藥典》（二部）中，苯甲醇的過氧化值限度為5。若參照2010年版《中國藥典》（一部）的公式換算，苯甲醇的過氧化值限值應為0.06345%。

2010年版《中國藥典》（一部）的茶油各論中無過氧化值檢查項，因此無合適的限度。由于《中國藥典》收載的茶油為壓榨法得到的，可參考國家標準GB 11765-2003《油茶籽油》對壓榨成品油茶籽油的規定:一級品過氧化值≤6.0%，酸值≤1.0；二級品過氧化值≤7.5%，酸值≤2.5。可見，食用壓榨茶油的酸值要求均要嚴于《中國藥典》的藥用茶油，而食用茶油二級品的酸值限度與藥用茶油比較接近。因此，筆者采用食用壓榨茶油二級品的過氧化值限度，即7.5%作為藥用輔料茶油的過氧化值限度。由于GB 11765-2003中《油茶籽油》的過氧化值計算公式與2010年版《中國藥典》（二部）一致，故以2010年版《中國藥典》（一部）的公式換算，限值應為0.09518%。

經對處方量的原輔料分別進行滴定試驗，發現苯甲酸芐酯和戊酸雌二醇對過氧化值結果均無貢獻，而庚酸炔諾酮對過氧化值的結果有一定的貢獻，將滴定結果根據“2.2”項下計算公式計算，得到庚酸炔諾酮的過氧化值滴定結果為0.2550%。由于4批CNEI中庚酸炔諾酮的含量差異不大，且通過破壞試驗后的高效液相色譜法含量測定結果得知，在正常的貯存條件下，庚酸炔諾酮穩定性較好，可以假定庚酸炔諾酮在貯存周期內對過氧化值的貢獻值不發生改變。將茶油和苯甲醇的過氧化值限度分別乘以各自在處方中的權重系數后相加，再加上庚酸炔諾酮的過氧化值滴定結果乘以其在處方中的比例（均以質量比計算），即得CNEI的過氧化值限度，應為0.06127%。結果，除批號為100701的CNEI的過氧化值小于該限值以外，其余3批CNEI的過氧化值均超出了限度；而2008年生產的2批CNEI的過氧化值均比2010年生產的2批樣品要高，證明了本品在貯存過程中，有過氧化物的增長。

3.3 苯甲醛與酸敗度相關性

2010年版《中國藥典》（二部）中規定苯甲醇中含苯甲醛不得過0.2%，美國USP 32-NF27中規定苯甲酸芐酯中含苯甲醛不得過0.05%。苯甲醛為CNEI輔料中的一個重要雜質，對CNEI中的苯甲醛采用氣相色譜法進行測定，色譜見圖1。

圖1 氣相色譜圖A.對照品；B.供試品；1.苯甲醛；2.苯甲醇；3.苯甲酸芐酯（其余峰均為DMA峰）Fig 1 GC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.benzaldehyde；2.benzyl alcohol；3.benzyl benzoate（all other peaks belong to DMA）

由于苯甲酸芐酯中的苯甲醛也主要是由其堿解為苯甲醇后氧化而來的，因此CNEI中苯甲醛的主要來源為苯甲醇。可以將樣品中的苯甲醛以CNEI所含苯甲醇的量折算而得，結果詳見表2。

表2 CNEI中苯甲醛的含量測定結果（m/V）Tab 2 Result of content determination of benzylaldehyde in 4 batches of CNEI（m/V）

4批CNEI中苯甲醛含量的差異很大，2008年生產的2批樣品中含苯甲醛均為2010年樣品的10倍左右。可見，隨貯存時間的延長，本品產生了較多苯甲醛，且均大大超出了2010年版《中國藥典》（二部）對苯甲醇中含苯甲醛不得過0.2%的要求。

為考察CNEI中苯甲醛含量與茶油的酸值或過氧化值的關系，采用OriginPro 8統計軟件進行統計學分析，將4批樣品的苯甲醛含量分別與各自測得的酸值及過氧化值進行相關性考察。對數據進行預分析，由于變量不呈雙變量正態分布，不適合使用參數統計方法計算，因此采用非參數統計方法計算Spearman相關系數。結果，苯甲醛含量與酸值和過氧化值的Spearman相關系數均為0.949，單側P值均為0.026，即在置信度（單側）為0.05時，其相關性均是顯著的，且呈正相關。根據上述結果，筆者推測茶油的酸敗過程可能會加速苯甲醛的產生，同時苯甲醛大量產生能加劇茶油的酸敗過程。本文所檢測的4批CNEI可采用測定苯甲醛含量的方法預估輔料茶油的酸敗度。

4 討論

近年來，茶油在醫藥行業受到了越來越廣泛的應用[5]。注射用油的安全性指標除了常規的熱原、細菌內毒素和無菌等項目外，輔料的酸敗度也是一個重要的參考依據。作為具有安全高風險的注射劑，其輔料酸敗后產生的有毒物質對人體的影響應受到高度重視。2010年版《中國藥典》（一部）的茶油各論中無過氧化值檢查項，筆者認為該項目是檢驗茶油質量高低的重要參數，也是茶油國家標準中的主要質量指標，建議在今后的藥典修訂中加以考慮。

CNEI的特殊性在于其輔料中還含有苯甲醇，且苯甲醇易氧化成為苯甲醛。苯甲醛的含量是影響本注射液安全性的另一個重要指標。由于本品中苯甲醛的含量與酸敗程度呈顯著正相關，貯存時間長的樣品中苯甲醛的含量較高，且苯甲醛本身也有一定的毒性，故建議在CNEI的藥典標準修訂中增加苯甲醛的檢查項，以更好地監控本注射液的質量。另外，對其他含苯甲醇的注射液中苯甲醛含量的監控也應加以重視。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:386-387.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:1182-1183.

[3]李冬梅，王婧，畢良武，等.提取方法對茶油中活性成分角鯊烯含量的影響[J].生物質化學工程，2006，40（1）:9.

[4]顏永剛，裴瑾，鄧翀.桃仁的酸敗度測定及其限度值的分析[J].河南中醫，2010，30（5）:510.

[5]李麗，吳雪輝，寇巧花.茶油的研究現狀及應用前景[J].中國油脂，2010，35（3）:10.