不同濃度雌激素對人源性牙周膜干細胞成骨分化能力的影響

夏 冰 杭州市紅十字會醫(yī)院口腔科 杭州 310003

·實驗研究·

不同濃度雌激素對人源性牙周膜干細胞成骨分化能力的影響

夏 冰 杭州市紅十字會醫(yī)院口腔科 杭州 310003

目的：對比研究不同濃度的雌激素對人源性牙周膜干細胞成骨分化的影響。方法：采用DMEM完全培養(yǎng)基將人牙周膜干細胞制成單細胞懸液，分別加入濃度為0、10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素，以未加入雌激素的成骨誘導液組（普通DMEM培養(yǎng)基中加入10mM β-甘油磷酸鈉、50μM維生素C及10nM地塞米松）作為陰性對照。培養(yǎng)后實時定量PCR方法分別檢測成骨早中晚期關鍵指標Runx2、ALP和OCN mRNA表達。結(jié)果：濃度為10×10-10、10× 10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素對人源性的牙周膜干細胞培養(yǎng)均無毒性；不同濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在成骨誘導7、14、21天時，Runx2、ALP及OCN mRNA表達在10×10-7組最高（P＜0.05～0.01）。在不同濃度雌激素組中成骨相關基因的表達均高于陰性對照組（P＜0.05）。結(jié)論：當雌激素濃度＜10×10-7mol/L時，雌激素能夠以劑量依賴的方式促進人牙周膜干細胞成骨分化過程中成骨相關基因的表達。當雌激素濃度＞10×10-7mol/L時，雌激素濃度的增加并未促進成骨相關基因的表達。

牙周膜干細胞 成骨分化 雌激素

雌激素是骨骼系統(tǒng)中最為重要的調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控女性骨骼新陳代謝方面發(fā)揮重要作用[1]，絕經(jīng)期婦女由于雌激素的缺乏容易導致骨質(zhì)疏松等疾病。牙槽骨是人類骨組織中代謝最為活躍的部位之一，極易受雌激素水平的影響，從而引發(fā)牙周疾病，進而危害人類的口頜系統(tǒng)及身心健康。牙周膜干細胞是一類取自于牙周膜的間充質(zhì)來源的成體干細胞，由于其在特定的條件下可以分化為成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和成膠原細胞等，在維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)，維護牙槽骨的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用[2]。本研究就不同濃度的雌激素對人源性牙周膜干細胞成骨分化的影響進行了初步探討，報道如下。

1 實驗材料

1.1 人源性牙周膜干細胞來源 由第四軍醫(yī)大學牙體牙髓科嚴妍博士惠贈[3]。

1.2 試劑及儀器 DMEM完全培養(yǎng)基（Gibico，美國），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國，Thermo公司），相差倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本，Olympus公司），MTT（Sigma，美國），DMSO（Sigma，美國），β-甘油磷酸鈉（Sigma，美國），維生素C（Sigma，美國），地塞米松（Sigma，美國），Trizal（Invitrogen，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，中國），紫外分光光度計（Eppendorf，德國），全自動酶標儀（美國，Rayto公司），UDG染料（全式金，中國），本實驗所采用的引物由上海生物工程技術有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 人源性牙周膜干細胞取材及培養(yǎng) 采用含有10%（體積分數(shù)）胎牛血清（Gibico，美國）的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、含5%CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察牙周膜干細胞的生長情況，待細胞鋪滿瓶底大約90%時，采用0.25%的胰酶消化后，將消化的人牙周膜干細胞以1:3的比例進行傳代培養(yǎng)。取第四代細胞進行實驗。

2.2 不同濃度雌激素對人源性牙周膜干細胞的毒性實驗 DMEM完全培養(yǎng)基將人牙周膜干細胞制成單細胞懸液，以每孔8×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔體積約200μL。培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素分別培養(yǎng)48、96h后棄培養(yǎng)基，每孔中加入100μL MTT溶液，37℃溫箱孵育6h后終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加入150μL DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解后，酶標儀檢測。

2.3 不同濃度雌激素對人源性牙周膜干細胞成骨的分化誘導 將細胞懸液以每皿3×103個細胞的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，成骨誘導液中分別加入濃度為10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素。以未加入雌激素的成骨誘導液組（普通DMEM培養(yǎng)基中加入10mM β-甘油磷酸鈉、50μM維生素C及10nM地塞米松）作為陰性對照。每3天換1次液。分別培養(yǎng)7、14、21天。

2.4 實時定量PCR方法檢測成骨不同階段的關鍵指標Runx2、ALP和OCN的mRNA表達 于7、14、21天分別收取細胞，以Trizal提取細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測其含量和純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其以1: 10倍稀釋待用。PCR反應引物（由上海生物工程技術有限公司合成）：18S：上游5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’，下游5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’；Runx2：上游5’-TGGTTACTGTCATGGCGGGTA-3’，下游5’-TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA-3’；ALP：上游5’-GGGACTGGTACTCAGACAACG-3’，下游5’-GTAGGCGATGTCCTTACAGCC-3’；OCN：上游5’-GGCGCTACCTGTATCAATGG-3’，下游5’-GTGGTCAGCCAACTCGTCA-3’。總反應體系20μL，其中模板cDNA 2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，反應液10μL，ddH2O 8μL，反應條件為：50℃2min，95℃2min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)40次。以18S為內(nèi)參。以上實驗采用不同的原代標本重復3次取均值。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行方差分析，以P＜0.05為有差異統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 人牙周膜干細胞的特性 倒置顯微鏡下觀察，牙周膜干細胞多呈長梭形，有1～2個突起。細胞核為卵圓形，位于細胞質(zhì)的中央。形態(tài)與成纖維樣細胞類似。少數(shù)細胞形態(tài)為不規(guī)則的多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小，胞體豐滿。傳代后細胞生長良好。

3.2 不同濃度雌激素的細胞毒性實驗 雌激素能夠調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖與分化[4]，所以首先本實驗采用MTT的方法檢測不同濃度的雌激素對人源性牙周膜干細胞的細胞毒性，實驗中所采用的濃度為10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素對人源性的牙周膜干細胞培養(yǎng)均無毒性。不同濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 不同濃度雌激素處理人牙周膜干細胞48h、96h后細胞活性

3.3 不同濃度雌激素對人源性牙周膜干細胞成骨相關基因表達的影響 實時定量PCR結(jié)果顯示，成骨誘導第7、14、21天，標志著成骨不同階段的關鍵指標Runx2、ALP及OCN的基因表達水平相對于DMEM對照組顯著上升。在成骨誘導7、14、21天時，成骨相關基因Runx2、ALP及OCN的基因水平表達在10×10-7組表達量最高（aP＜0.05，bcP＜0.01）。在不同濃度雌激素組中成骨相關基因的表達均高于陰性對照組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度雌激素處理牙周膜干細胞7、14、21天后，Runx2、ALP及OCN mRNA表達，與0mol/L組比較，aP＜0.05，b、cP＜0.01

4 討論

牙周病是一類發(fā)生于牙槽骨的炎癥性骨吸收疾病，是造成牙齒松動、牙列缺失及缺損的主要原因，影響了世界上大約20%人口的口頜系統(tǒng)健康[5]。嚴重的牙周炎癥得不到有效控制，會造成牙槽骨及根尖周組織的不可逆性損害，從而危害人類的口頜系統(tǒng)乃至身心健康。牙周膜干細胞是一類來自于牙周膜的成體干細胞，它不同于胚胎干細胞等涉及到倫理等敏感問題，同時卻具有類似于胚胎干細胞的多向分化潛能，在牙槽骨及牙周組織的再生修復過程中顯示了巨大的潛力[6]。

由于牙周膜干細胞能夠同時表達ERα和ERβ受體，所以它被廣泛認為屬于雌激素的一個靶器官。在大鼠的卵巢切除模型中，雌激素能夠通過與雌激素受體相互作用促進鼠源性牙周膜干細胞的成骨分化[7]。此外，雌激素還能夠通過劑量依賴效應促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[4]。除卻雌激素外，許多類雌激素功能的黃酮類物質(zhì)，例如染料木堿（一類黃酮類類雌激素物質(zhì)）、柚皮素的衍生物（naringenin-6-C-glucoside（NCG））、TAK78等同樣能夠模仿雌激素的生理功能促進成骨細胞的成骨向分化[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，10×10-10～10×10-5mol/L濃度的雌激素對人牙周膜干細胞無毒性。成骨誘導過程中外源性雌激素的加入能夠上調(diào)成骨相關指標Runx2、ALP和OCNmRNA的表達。

牙周膜干細胞向成骨細胞的分化過程受一系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制。其中Runx2是調(diào)控成骨分化過程中最關鍵的調(diào)控因子，它對成骨細胞的分化、成熟和骨的形成有著決定的作用[11]。Runx2不僅是成骨分化過程中最先表達的轉(zhuǎn)錄因子，它還能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子osterix以及骨形成相關基因，如I型膠原酶、ALP、骨涎蛋白、骨形成蛋白、OCN等的表達[11-13]。除此之外，ALP和OCN等骨形成相關基因在骨基質(zhì)的礦化、成熟方面也發(fā)揮了重要作用[14]。為了研究不同濃度雌激素對人牙周膜干細胞成骨分化能力的影響，本研究選取檢測不同時間點Runx2、ALP和OCN的變化。發(fā)現(xiàn)Runx2的表達量在第7天達到峰值，ALP和OCN分別在第14天和第21天達到峰值。

本研究發(fā)現(xiàn)，當濃度＜10×10-7mol/L時，雌激素能夠以劑量依賴的方式促進人牙周膜干細胞成骨分化過程中成骨相關基因的表達。當濃度＞10×10-7mol/L時，雌激素濃度的增加并未促進成骨相關基因的表達。朱曉斐等[4]研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠通過劑量依賴效應促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，本研究結(jié)果與之基本一致。在后期的研究中，我們將進一步對雌激素促進人牙周干細胞的成骨分化機制進行探討，為臨床中由于雌激素缺乏引起的牙周疾病的治療提供理論依據(jù)。

［1］Khosla S，Melton LJ 3rd，Riggs BL.The unitary model for estrogen deficiency and the pathogenesis of osteoporosis:is a revision needed［J］.Bone Miner Res，2011，26（3）：441.

［2］Seo BM，Miura M，Batouli S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament.［J］.Lancet，2004，364（9429）：149-155.

［3］Yan Y，Zeng W，Song S，et al.Vitamin C induces periodontal ligment progenitor cell differentiation via activation of ERK pathway mediated by PELP1［J］.Protein Cell，2013，4（8）：620-627.

［4］朱曉斐，毛飏，金巖，等.雌激素劑量依賴性促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化［J］.中國組織工程研究，2012，16（19）：3433-3437.

［5］Petersen PE，Bourgeois D，Ogawa H，et al.The global burden of oral diseases and risks to oral health［J］.Bull World HealthOrgan，2005，83（9）：661-669.

［6］Mao JJ，Giannobile WV，Helms JA，et al.Craniofacial tissue engineering by stem cells［J］.Dent Res，2006，85（11）：966.

［7］Zhang B，Li Y，Zhou Q，et al.Estrogen deficiency leads to impaired osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells in rats［J］.Tohoku J Exp Med，2011，223（3）：177-186.

［8］Heim M，F(xiàn)rank O，Kampmann G，et al.The phytoestrogen genistein enhances osteogenesis and represses adipogenic differentiation of human primary bone marrow stromal cells［J］.Endocrinology，2004，145（2）：848-859.

［9］Swarnkar G，Sharan K，Siddiqui JA，et al.A naturally occurring naringenin derivative exerts potent bone anabolic effects by mimicking oestrogen action on osteoblasts［J］.Br J Pharmacol，2012，165（5）：1526-1542.

［10］Bellesini LS，Beloti MM，Crippa GE，et al.The effect of TAK-778 on gene expression of osteoblastic cells is mediated through estrogen receptor［J］.Exp Biol Med（Maywood），2009，234（2）：190-199.

［11］Xiao G，Jiang D，Ge C，et al.Cooperative interactions between activating transcription factor 4 and Runx2/Cbfa1 stimulate osteoblast-specific osteocalcin gene expression［J］.Biol Chem，2005，280（35）：30689-30696.

［12］Gordon JA，Tye CE，Sampaio AV，et al.Bone sialoprotein expression enhances osteoblast differentiation and matrix mineralization in vitro［J］.Bone，2007，41（3）：462-473.

［13］Hinoi E，F(xiàn)ujimori S，Wang L，et al.Nrf2 negatively regulates osteoblast differentiation via interfering with Runx2-dependent transcriptional activation［J］.Biol Chem，2006，281（26）：18015-18024.

［14］Orimo H，Shimada T.The role of tissue-nonspecific alkaline phosphatase in the phosphate-induced activation of alkaline phosphatase and mineralization in SaOS-2 human osteoblast-like cells［J］.Mol Cell Biochem，2008，315（1-2）：51-60.

Effect of Estrogen on Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Ligament stem cells

XIA Bing.Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou（310003），China

Objective：To compare the effect of estrogen with different concentrations on osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells.Methods:Human periodontal ligament stem cell suspension was prepared with DMEM complete medium and then were cocultured with 0，10×10-10，10×10-9，10×10-8，10×10-7，10×10-6，and 10× 10-5mol/L of estrogen.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of osteogenic key indicators like Runx2，ALP，and OCN mRNA after coculture.Results：No toxic effect on human periodontal ligament stem cells was found in 10×10-10，10×10-9，10×10-8，10×10-7，10×10-6，and 10×10-5mol/L estrogen groups and no statistically significant difference was noted among these groups（P＞0.05）.On day 7，14，and 21 during osteogenic differentiation，the expression of Runx2，ALP，and OCN mRNA were the highest in 10×10-7estrogen group（P＜0.05～0.01）and were higher in all estrogen groups compared with the negative control group（0 estrogen group，P＜0.05）.Conclusion：Estrogen can promote bone-related gene expressions during osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells in a dose-dependent manner when its concentration was not more than 10×10-7mol/L.When estrogen levels were more than 10×10-7mol/L，the effect was not seen.

periodontal ligament stem cells osteogenic differentiation estrogen

2013-07-30