商陸皂苷甲對白細胞介素1β誘導的腎小球系膜細胞增殖及Caspase-3的影響

徐麗君 湯杰印 張祥貴 馬華林

商陸皂苷甲(Esculentoside A，EsA)是從中草藥商陸塊根中提純的一種三萜類皂苷，已被證實有顯著調節免疫、抗炎、抑制細胞增殖和促凋亡的作用[1-5]，在自身免疫性腎炎動物模型中顯示良好的治療效果[6-7]。本實驗選用大鼠腎小球系膜細胞(rGMC)為對象，觀察EsA對體外培養的rGMC增殖影響及促凋亡情況，并探討其作用機制，為其治療慢性腎臟病提供實驗和理論依據。

1 資料與方法

1.1 材料 rGMC株(HBZY-1)由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)提供；EsA購自上海同田公司，批號：10072431，白色粉劑(不溶于水)，于實驗前溶于0.1%DMSO溶液中；白細胞介素1 β（IL-1 β）購自Prospec公司，生產批號：#407 IL 1 B 01；MTT、DMSO、胰酶均購自Sigma公司，MEM培養液購自Genom公司，優級胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，兔抗大鼠Caspase-3 (武漢博士德公司)，Actin單克隆抗體(SantaCruz)，HRP標記山羊抗兔(KPL)，PVDF Western轉印膜(Millipore)，流式細胞儀(FACS Vantage DiVa，BD)，酶標儀(ELX 800)為Bio-Tek Instruments INK(美國)公司。

1.2 方法

1.2.1 rGMC培養 rGM購回后于倒置顯微鏡下見細胞呈梭形生長，鋪滿瓶底，培養液透明清亮，適應性培養4 h后吸取全部培養液（5% FBS的MEM）入無菌瓶內，并將FBS濃度由5%調整為10%做GMC培養備用。用PBS液洗細胞2 次，加入胰酶（含0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA和酚紅）消化細胞，見細胞變圓，呈片狀脫落時，加入10% FCS的MEM，終止消化，將細胞懸液移入離心管中，800 r/min，4 min離心后，棄去上清液，加入3 mL 10%FCS的MEM培養液重懸細胞，按1∶3 接種于25 mm培養瓶，每瓶加入10%FBS的MEM培養液至5 mL，吹打均勻，放入37℃，5% CO2培養箱中培養，換液2 d/次，細胞生長迅速，3 d傳1 次代。本實驗采用6～9 代rGMC。

1.2.2 分組 在檢測EsA對rGMC的增殖影響中，我們根據EsA濃度分為對照組及20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L共七組，并檢測24 h、48 h及72 h各組OD值；對Caspase-3 表達影響中，分為對照組及IL-1 β組與IL-1 β+EsA組共三組。

1.2.3 MTT法測定EsA對rGMC增殖的影響 取對數生長期rGMC接種于96 孔培養板，培養箱中孵育24 h后使rGMC同生長于G0 期。對照組加入10%FBS的MEM培養液，實驗組除加入上述培養液外，還分別加入終濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L用DMSO溶解的EsA，上述各組分別培養至24 h，48 h及72 h時，換新鮮培養液，按上述方法加入MTT培養4 h后，加入DMSO振蕩10 min溶解結晶物，在酶聯免疫檢測儀490 nm波長處測定各孔OD值。實驗重復4 次。

1.2.4 WB法檢測Caspase-3 的表達 提取按上述方法接種、培養、分組作用48 h后各組細胞總蛋白，每組1×106個細胞，用Bradford 法測定蛋白質濃度，并置于-2℃備用。每個樣品取30 μg蛋白質加入5×SDS凝膠加樣緩沖液使其終濃度成為1×，100℃煮沸5 min，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠45 V 40 min，分離膠120 V 90 min)后，200 mA電轉移轉至PVDF膜1 h，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋的Caspase-3 (1∶500)一抗和Actin單克隆抗體（1∶1000），室溫下孵育2 h，TBST洗膜，加1∶3000 TBST稀釋的二抗室溫孵育45 min，TBST洗膜，加入等體積混溶的A、B化學發光試劑，保持1.5 min，去盡殘夜，曝光成像。照片用GelDoc 2000 凝膠成像系統進行分析，確定雜交條帶的光密度值，用各組的光密度值/內參照光密度值進行統計學分析，實驗重復3～5 次。

1.2.5 統計學方法 使用SPSS 13.0 軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差(±s)表示，多組資料間均數比較采用方差分析；多個樣本均數的兩兩比較，方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者用Tamhane'sT2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎小球系膜細胞生長形態觀察 經傳代后rGMC，24 h后幾乎全部伸展貼壁，生長迅速，2～3 d鋪滿瓶底。在倒置顯微鏡下觀察，rGMC呈梭形、不規則形、紡錘形、胞核居細胞中央呈卵圓狀，胞體多突起，生長密集時，細胞接觸間隙可消失。見圖1。

圖1a:正常培養的腎小球系膜細胞形態(×40 倍)

圖1b:正常培養的腎小球系膜細胞形態(×200 倍）

2.2 EsA對rGMC的增殖影響 與對照組比較，EsA（2.5～5 mg/L）在48、72 h明顯抑制了細胞的增殖(P＜0.05 或P＜0.01)，見表1。

表1 EsA對rGMC增殖作用的OD值（±s）

表1 EsA對rGMC增殖作用的OD值（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與對照組比較，bP＜0.05

組別 n OD(24 h) OD(48 h) OD(72 h)對照組 6 0.529±0.081 0.808±0.021 1.331±0.219 EsA(20 mg/L) 6 0.547±0.362 0.863±0.903 1.218±0.165 EsA(10 mg/L) 6 0.547±0.097 0.880±0.080 1.330±0.146 EsA(5 mg/L) 6 0.508±0.018 0.642±0.060 a 0.966±0.325 a EsA(2.5 mg/L) 6 0.478±0.043 0.716±0.081 b 1.032±0.123 b EsA(1.25 mg/L) 6 0.479±0.026 0.815±0.056 1.271±0.185 EsA(0.625 mg/L) 6 0.473±0.053 0.805±0.041 1.232±0.218

2.3 EsA對IL-1 β誘導rGMC的Caspase-3 表達的影響 與對照組比較，IL-1 β組與IL-1 β+EsA組Caspase-3 表達均明顯增強（P＜0.05）；與IL-1 β組比較，EsA+IL-1 β組Caspase-3 的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠腎小球系膜細胞的Caspase-3 的表達

3 討論

EsA是從中國商陸塊根中提純而得到的一種三萜類皂苷化合物，既往研究顯示其具有顯著的抑制血清中炎性細胞因子(如IL-1、TNFα、IL-6、PAF及活性氮等)的產生及調節免疫系統的作用，具有抑制人角質形成細胞增殖，而改善銀屑病病情等作用[5]。研究顯示EsA具有抗炎、抑制細胞增殖和促凋亡的作用[8]。

rGMC是腎小球固有細胞之一，正常情況下，幾乎不增殖，炎癥狀態下，可被活化而異常增殖，引起細胞外基質(EMC)增加，降解減少，并釋放各種生物活性物質（如生長因子、細胞因子、反應性氧族等）趨化單核細胞及淋巴細胞進入病灶，使其釋放炎癥介質，進一步活化GMC，形成惡性循環，最終導致腎小球硬化及終末期腎臟病。由于GMC增殖是狼瘡性腎炎(LN)等多種腎小球疾病的共同病理表現，抑制GMC增殖對防治系膜細胞增殖性腎小球疾病有重要的臨床意義，并已成為研究的熱點。為明確EsA在LN等系膜細胞增殖性腎炎腎組織中的作用靶點及機制，同時考慮IL-1 β是刺激GMC活化的主要炎癥因子，其在腎臟疾病的發生和發展中的典型性，故本實驗選用了IL-1 β作為誘導因子，建立了體外IL-1 β誘導GMC增殖的模型。細胞增殖實驗結果顯示EsA(2.5～5 mg/L)對血清誘導的rGMC增殖48～72 h有顯著的抑制作用，IL-1 β誘導GMC增殖的實驗結果與文獻報道一致[9]。細胞增殖的實質是促進與抑制，增殖與凋亡的失衡[10]。細胞增殖是通過細胞周期來實現的，細胞的最終命運是在細胞周期水平由共同的調控者——細胞周期調節蛋白決定的[11]。

本研究發現，IL-1 β促進了GMC增殖的同時，也出現了Caspase-3 的表達上調及細胞細胞凋亡率明顯增加，說明細胞周期啟動后凋亡敏感性增加，細胞處于功能活躍階段易于凋亡[12]，即激活誘導性細胞凋亡(AICD)，進一步說明了細胞周期與細胞凋亡的協調（CAP）。同時在流式細胞儀檢測的結果中發現細胞凋亡處于早期，未檢測到晚期細胞凋亡和細胞壞死的凋亡峰，可能與實驗中時間的點選擇有關。本實驗中EsA對IL-1 β誘導的rGMC的細胞增殖中表現的凋亡并無促進作用，提示體外EsA作用于IL-1 β誘導的rGMC無促進凋亡作用，而其在體內的促進腎組織凋亡的作用，可能是EsA對GMC的凋亡無促進作用，而是促進了腎臟其他組織的凋亡，也可能是EsA通過影響多重細胞因子的分泌，調整了體內Th1/Th2的細胞因子平衡，或是通過體內的生物轉化后產生其他生物活性物質而促進了GMC等腎組織的凋亡，IL-1 β也可能會對不同的細胞或者細胞在不同的環境誘導中表現出凋亡或增殖為主的現象，需行進一步研究以證實。

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