適于魷魚肌肉組織中菌群特征分析的PCR-DGGE方法的建立

鄧弘毅，王 月，丁林賢，王建玲，金 楊

(1.臺州出入境檢驗檢疫局，浙江 臺州 318000;2.浙江師范大學，浙江 金華 321004)

魷魚，屬軟體動物的門頭足綱，其肉質鮮美，風味與鮑魚類似，國外有將魷魚加工成類似鮑魚的罐頭出售，因此魷魚又被冠以“窮人的鮑魚”的美稱，是廣受歡迎的水產品之一［1］。但由于其水分含量高，蛋白質豐富，微生物含量較多，特別容易腐敗變質，因此會引發一系列食品安全問題。目前關于食品中菌群特征方面的研究，國內外已有不少報道，但許多研究仍停留在傳統的微生物鑒定法。由于自然界中有85%～99%的微生物至今還不可培養，因此傳統的微生物鑒定法具有一定的局限性［2］。近年來，隨著分子生物學的發展，越來越多的分子生物學手段被引入到食品微生物學的研究中。其中，基于傳統PCR技術發展起來的PCR-變性梯度凝膠電泳 (DGGE)指紋分析技術就是一種可以有效避開微生物的分離培養階段，直接從食品中提取總DNA，揭示樣品中的微生物組成和動態變化的方法。

該方法首先由 Fischer等［3］于 1979年提出，1985年 Myers等［4］首次在 DGGE中使用 “GC夾板”和異源雙鏈技術，使該技術日臻完善。目前，PCR-DGGE技術已廣泛應用于環境微生物的微生物生態和種群群落的研究，并在食品領域尤其在水產品保鮮及加工中得到了一定的應用。如Hovda等［5］利用該技術對氣調包裝大馬哈魚中的優勢菌群進行分析，發現傳統以及改良的氣調包裝大馬哈魚中的優勢菌群為磷發光桿菌、熱殺索氏菌和假單胞菌屬。Yoshikawa等［6］對大馬哈魚子醬發酵過程中的菌群情況研究時發現耐鹽性酵母菌、假絲酵母等4種真菌是大馬哈魚子醬發酵過程中的優勢菌群。

進行DGGE分析的首要問題就是樣品中總細菌DNA的提取。作者以凍融法、勻漿法和搖床法3種方法處理魷魚樣本，采用SDS法結合蛋白酶K法直接對魷魚組織中的細菌基因組DNA進行提取，建立了一套適合魷魚組織中菌落結構分析的方法，為進一步研究魷魚腐敗機理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮魷魚為購自金華市果蔬水產批發市場的冰鮮魷魚，無菌水洗滌，室溫放置至出現輕度腐敗味時進行取樣分析。

1.2 魷魚肌肉組織中細菌總DNA的提取

在無菌操作條件下將魷魚肌肉組織剪碎，稱取6份10 g樣品，采用凍融法、搖床法和勻漿法進行前處理，各方法均重復2次［7］。

1.2.1 凍融法

取10 g樣品置于無菌離心管中，液氮處理2min后放于65℃水浴中保溫至完全融化，反復凍融3次。將樣品轉移至無菌錐形瓶中，加入90mL無菌TE緩沖液，充分搖勻，靜置5min，取上清液50mL，10000 r·min-1離心10min，待用。

1.2.2 勻漿法

取10 g樣品置于無菌玻璃勻漿器中充分勻漿后轉移至無菌錐形瓶中，加入90mL無菌TE緩沖液，充分搖勻，靜置 5min，取上清液 50mL，10000 r·min-1離心 10min，待用。

1.2.3 搖床法

取10 g樣品置于無菌錐形瓶中，加入10 g無菌玻璃珠和90mL無菌TE緩沖液，200 r·min-1、4℃振蕩處理30min，靜置5min，取上清液50mL，10000 r·min-1離心 10min，待用。

1.2.4 細菌總DNA的提取

3種處理后所得沉淀用10mL TE懸浮，加入0.5mL 10%SDS，50μL蛋白酶 K，混勻，37℃孵育 1 h。加入 1.5mL 5 mol·L-1NaCl，1.5mL CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃孵育20min。用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，10000 r·min-1離心10min取上清，重復上述操作直至兩相交界面無白色物質出現為止。取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000 r·min-1離心 10min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，10000 r·min-1離心15min得到DNA沉淀。加入 700μL 75% 乙醇，70μL 3mmol NaAc漂洗 DNA沉淀后，溶解于1mL TE，-20℃保存。

1.3 16 S rDNA的PCR-DGGE圖譜的構建

1.3.1 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR擴增

DNA用無菌水分別連續作3倍梯度稀釋，進行PCR擴增。

PCR引物:8 F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’)和 1510 R(5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’)。

PCR反應體系:Primer 1μL，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP Mixture 5.0μL， DNA 1.0μL，TaKaRa Ex Taq 0.3μL 和 ddH2O 37.7μL。

PCR擴增程序:94℃預變性2min;94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環;最后72℃延伸2min。

1.3.2 16 S rDNA V3區片段的PCR擴增

PCR 引 物:GC357F(5’-CGCCCGCCGCG CGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGCCACCTACG GGAGGCAGCAG-3’) 和 517 R(5’-ATTACCGC GGCTGCTGG-3’)。

PCR反應體系:Primer 1μL，2×GC Buffer II 25.0μL，dNTP Mixture 8.0μL， DNA 1.0μL，TaKaRa La Taq 0.5μL 和 ddH2O 14.5μL。

PCR擴增程序:94℃預變性5min;94℃變性1min，55℃退火 1min，72℃延伸 1.5min，305個循環;最后72℃延伸5min。

1.3.3 DGGE圖譜的建立與分析

DGGE電泳采用 Muyzer等［8］的方法，電泳條件為恒溫60℃，電壓85 V，聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，電泳時間14 h。電泳結束后，EB染液浸染15min，再用ddH2O漂洗5min，UVP凝膠成像系統照相。

2 結果與分析

2.1 魷魚肌肉組織細菌總DNA的提取

魷魚樣品采用3種不同前處理后所提取的細菌總DNA電泳圖如圖1所示，結果表明經3種前處理方法后均能成功提取魷魚肌肉組織細菌的總DNA。其中，勻漿處理較其他2種處理所得DNA電泳條帶要亮很多，說明勻漿處理提取DNA的產率最高。搖床處理次之，凍融處理提取DNA的產率最低。

圖1 魷魚肌肉組織細菌總DNA提取電泳圖

2.2 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR擴增

以提取的魷魚肌肉組織細菌總DNA及其相應的稀釋梯度為模板，以8 F和1510 R為引物進行第1套PCR擴增，結果如圖2所示，所得產物是大小約1500 bp的16 S rDNA片段，且隨著稀釋梯度的加大，條帶亮度先增強后減弱。

2.3 細菌16 S rDNA V3區片段的PCR擴增

圖2 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR擴增結果

以第1套PCR擴增產物為模板，以GC357 F和517 R為引物進行第2套PCR擴增，結果如圖3所示，所得產物是大小約160 bp的片段。

圖3 細菌16 S rDNA V3區片段PCR擴增結果

2.4 DGGE圖譜的建立

用第2輪PCR擴增產物在變性梯度30%～60%進行DGGE電泳，結果如圖4。由圖4可知，DGGE共分離產生5條較明顯的條帶，3種方法所得圖譜均相似，且都存在明顯的主次帶之分。

圖4 細菌16 S rDNA V3區DGGE圖譜

3 小結與討論

PCR-DGGE方法避開了傳統微生物培養分離的環節，直接提取微生物總DNA，獲得種群的DNA信息，較為真實地揭示樣品中微生物的實際組成，理論上只要實驗條件適當，DGGE技術便可區分1個堿基差別的DNA片段［9］。但是，如何從樣品中直接提取微生物總DNA，這是DGGE分析首先要解決的問題，可以說高質量和高產量的基因組DNA的提取是PCR-DGGE分析的前提和基礎。一般來說，直接從魷魚組織中提取細菌DNA需要對樣品進行前處理。前處理方法的不同可能會影響DNA提取的效果及后續的PCR擴增和DGGE分析。凍融法、勻漿法和搖床法3種前處理對魷魚組織中細菌DNA的提取效果及對DGGE分析影響實驗的結果表明，勻漿處理提取DNA的產率最高，搖床處理次之，凍融處理最低。PCR-DGGE分析表明3種前處理形成的條帶分布相似，且都存在明顯的主次帶之分，說明這3種前處理對后續PCR-DGGE分析的影響無明顯差異。但是，就具體試驗來說，搖床法和凍融法分別采用無菌錐形瓶和無菌離心管，所以能同時處理多個樣本，而勻漿法在處理每一個樣品時需對勻漿器進行滅菌，故該方法不適于處理大量樣本。

魷魚是一類蛋白質含量豐富的水產品，100 g魷魚鮮品中的蛋白質含量就高達16～18 g［10］，雜蛋白一方面會影響DNA的溶解，另一方面也會干擾后續的PCR反應，因此盡可能的去除雜蛋白也是建立適于魷魚組織的DGGE分析方法的關鍵問題。一般來說，為獲取高純度的DNA樣本都需要對DNA樣本進行純化，但是常用的DNA純化方法容易導致DNA樣本的嚴重損失，最終導致微生物多樣性的下降。本試驗通過簡單的提高抽提次數并結合DNA稀釋法，降低雜質在DNA模板中的濃度，獲得了高質量的DNA樣本，直接用于PCR擴增，有效避開了DNA純化步驟，在很大程度上避免了DNA樣本的流失，更為真實地反映待測樣品中微生物的菌群特征。

［1］吳少杰，張俊杰，姚興存，等.我國魷魚的綜合加工利用現狀與展望 ［J］.食品研究與開發，2011，32(1):154-156.

［2］辜運富，張小平，涂仕華.變性梯度凝膠電泳 (DGGE)技術在土壤微生物多樣性研究中的應用 ［J］.土壤，2008，40(3):344-350.

［3］Fischer S G，Lerman L S.DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels:correspondence with melting theory ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1983，80(6):1579-1583.

［4］Myers R M，Fischer S G，Lerman L S，et al.Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Nucleic Acids Research，1985，13(9):3131-3145.

［5］Hovda M B， Sivertsvik M， Lunestad B T， et al.Characterisation of the dominant bacterial population in modified atmosphere packaged farmed halibut (Hippoglossus hippoglossus)basedon 16SrDNA-DGGE ［J］.Food Microbiology，2007，24(4):362-371.

［6］Yoshikawa S，Yasokawa D，Nagashima K，et al.Microbiota during fermentation of chum salmon(Oncorhynchus keta)sauce mash inoculated with halotolerant microbial starters:analyses using the plate count method and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) ［J］.Food Microbiology，2010，27(4):509-514.

［7］江蕓，高峰，徐幸蓮，等.冷卻豬肉不同前處理對細菌DNA提取及PCR-DGGE的影響 ［J］.食品科學，2010，31(6):258-262.

［8］Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbialpopulations by denaturing gradientgel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700.

［9］Amann R I， Ludwig W， SchleiferK H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation ［J］.Microbiological Reviews，1995，59(1):143-169.

［10］陳意.魷魚的營養及食用價值 ［J］.食品與藥品，2006，8(6):75.