小兒感冒顆粒微生物限度檢查方法的建立及驗證

韋永樸 將秋香

廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006

小兒感冒顆粒微生物限度檢查方法的建立及驗證

韋永樸 將秋香

廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006

目的：建立小兒感冒顆粒微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2010年版一部微生物限度檢查方法的要求進行驗證試驗。結(jié)果：小兒感冒顆粒微生物限度檢查細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法采用常規(guī)法進行驗證試驗，試驗組的菌回收率均不低于70%；控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）檢查方法用大腸埃希菌采用常規(guī)法（100mL／瓶、10mL／支）進行驗證試驗，試驗組、陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長。結(jié)論：小兒感冒顆粒微生物限度檢查細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法可用常規(guī)法（1mL／皿）測定，控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）檢查方法可用常規(guī)法（100mL／瓶、10mL／支）進行檢查。

小兒感冒顆粒；微生物限度檢查

廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的小兒感冒顆粒，由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍根、地黃、地骨皮等經(jīng)煎煮、濃縮、提取揮發(fā)油等制劑而成，具有疏風解表、清熱解毒作用。主要用于小兒風熱感冒，癥見發(fā)熱重、頭脹痛、咳嗽痰黏、咽喉腫痛，流感等；該產(chǎn)品收載于中國藥典2010年版一部及國家基本藥物目錄。按《中國藥典》要求應進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）的檢查，經(jīng)過大量的試驗，制定了該產(chǎn)品的微生物限度檢查的方法，并按《中國藥典》有關(guān)規(guī)定進行驗證，結(jié)果符合其規(guī)定的要求，方法可行。

1 實驗儀器與材料

1.1 樣品 小兒感冒顆粒（廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司，批號：20100701、20100702、20100703）。

1.2 實驗菌種 大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC （B）63501］白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98 003］均由廣西食品藥品檢驗所提供。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、4－甲基傘形酮葡萄糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基、4－甲基傘形酮葡萄糖對照培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂對照培養(yǎng)基、膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵對照培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵對照培養(yǎng)基均由中國藥品生物制品生產(chǎn)。

1.4 稀釋劑 pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.5 儀器及設(shè)施 電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微波爐、接種柜、高壓滅菌鍋、旋渦混合器、電熱干燥箱、環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域等。1.6 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌第3代的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18～24h，培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含50～100cfu的菌懸液；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含50～100cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7天，加入10mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子50～100cfu的孢子懸液。備用。

2 細菌數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的建立

2.1 培養(yǎng)基適用性檢查

2.1.1 細菌用培養(yǎng)基適用性檢查 按規(guī)定程序新鮮配制營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。取7個無菌平皿，分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對照，然后傾注營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基；另取7個無菌平皿，分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對照，然后傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。最后把平皿置33℃培養(yǎng)48h，計數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 細菌用培養(yǎng)基適用性試驗結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

2.1.2 霉菌及酵母菌用培養(yǎng)基適用性檢查 按規(guī)定要求新鮮配制玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基，取5個無菌平皿，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對照，然后傾注玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基；另取5個無菌平皿，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對照，然后傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。最后把平皿置25℃培養(yǎng)72h，計數(shù)。結(jié)果見表2。

被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)均大于對照培養(yǎng)基上的菌落平均的70%，符合《中國藥典》2010年版一部要求。

2.2 供試液制備 取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，制成1：10的供試液。

表2 霉菌及酵母菌用培養(yǎng)基適用性試驗結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

2.3 方法的建立 本品由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍根、地黃、地骨皮等經(jīng)煎煮、濃縮、提取揮發(fā)油等制劑而成，經(jīng)查閱相關(guān)資料及多年積累的經(jīng)驗，確認處方中所用的藥材抑菌作用不強。故確定細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法，選擇金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株，對2.2供試液制備中的方法分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL／皿）、培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）對試驗組、菌液組、供試品對照組進行多次的預試驗，按公式計算回收率，結(jié)果見表3.

表3 小兒感冒顆粒回收率預試驗結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

2.4 方法的確定及驗證 從預試驗結(jié)果來看，金黃色葡萄球菌采用常規(guī)法回收率為98.1%，培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL／皿）回收率為101.9%，培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）回收率為99.0%，確定細菌數(shù)計數(shù)方法采用常規(guī)法。白色念珠菌常規(guī)法回收率為94.6%，培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL／皿）回收率為94.6%；三種方法的菌回收率均大于70℅，符合《中國藥典》2010年版一部微生物限度檢查的要求，故確定霉菌和酵母菌數(shù)計數(shù)方法采用常規(guī)法。

2.5 樣品測定 取3個批號小兒感冒顆粒，細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法采用常規(guī)法（1mL／皿），分別加入藥典要求的五種驗證菌株進行回收率試驗，結(jié)果見表4。

表4 小兒感冒顆粒回收率試驗結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

批號菌種大腸埃希菌［CMCC（B）44102］金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］白色念珠菌［CMCC（F）98001］黑曲霉［CMCC（F）98003］平皿號12平均值12平均值12平均值12平均值12平均值試驗組20100703 767374575355656464677571414543菌液組776270576360677068768480475652供試品對照組000000000000000回收率（%）105.791.794.188.882.7

3個批號樣品的驗證試驗結(jié)果表明，小兒感冒顆粒細菌計數(shù)方法采用常規(guī)法（1mL／皿）、霉菌和酵母菌數(shù)計數(shù)方法采用常規(guī)法（1mL／皿）進行檢驗，五種規(guī)定試驗菌的回收率均大于70%，符合《中國藥典》2010年版的規(guī)定，方法可行。

3 控制菌檢查方法的建立

3.1 大腸埃希菌

3.1.1 培養(yǎng)基適用性檢查 按要求新鮮配制曙紅亞甲藍對照瓊脂培養(yǎng)基及檢查用曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基，然后分別注平板，冷卻后取0.1mL的大腸埃希菌菌液（約50～100cfu）分別涂布于上述平板；取0.1mL的大腸埃希菌菌液（約50～100cfu）分別加入4－甲基傘形酮葡萄糖對照培養(yǎng)基及檢查用4－甲基傘形酮葡萄糖培養(yǎng)基，膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基及檢查用膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時取0.1mL的金黃色葡萄糖球菌菌液（約50～100cfu）分別加入另兩瓶膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基及檢查用膽鹽乳糖培養(yǎng)基。然后置33℃培養(yǎng)24h，結(jié)果見表5。

表5 大腸埃希菌培養(yǎng)基適用性實驗結(jié)果

檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示能力符合《中國藥典》2010年版一部要求。

3.1.2 方法的建立 試驗組：取1：10供試液10mL及10 ～100cfu試驗菌（大腸埃希菌）加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陽性對照組：取10～100cfu試驗菌（大腸埃希菌）加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陰性對照組：取0.9%無菌氯化鈉溶液10mLL加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。將上述各組置33℃培養(yǎng)18～24h。取各培養(yǎng)液0.2mL，分別接種至5mLMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5～24h時，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，再觀察結(jié)果，結(jié)果見表6。

由表6可知，試驗組、陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長。可按此供試液制備法按常規(guī)法進行大腸埃希菌檢驗，方法可行。

表6 大腸埃希菌的實驗結(jié)果

3.2 大腸菌群

3.2.1 培養(yǎng)基適用性檢查 按要求新鮮配制乳糖膽鹽發(fā)酵對照培養(yǎng)基及檢查用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵對照培養(yǎng)基及檢查用乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，取0.1mL的大腸埃希菌菌液（約50～100cfu）分別加入乳糖膽鹽發(fā)酵對照培養(yǎng)基及檢查用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵對照培養(yǎng)基及檢查用乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時取0.1mL的金黃色葡萄糖球菌菌液（約50～100cfu）分別加入另兩瓶乳糖膽鹽對照培養(yǎng)基及檢查用乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。然后置33℃培養(yǎng)24h，結(jié)果見表7。

表7 大腸菌群培養(yǎng)基適用性實驗結(jié)果

檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示能力符合《中國藥典》2010年版一部要求。

3.2.2 方法的建立 試驗組：取1：10供試液1mL及10 ～100cfu試驗菌（大腸埃希菌）加入10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。陽性對照組：取10～100cfu試驗菌（大腸埃希菌）加入10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。陰性對照組：取0.9%無菌氯化鈉溶液1mL加入10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。將上述各組置33℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果，然后分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基平板35℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，再從上述平板上挑取4～5菌落分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。結(jié)果見表8。

由表8可知，試驗組、陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長。可按此供試液制備法按常規(guī)法進行大腸菌群檢驗，方法可行。

表8 大腸菌群的實驗結(jié)果

4 結(jié)果與討論

按上述擬定的小兒感冒顆粒微生物限度檢查法，對三批樣品進行檢驗，以考查該方法的可靠性及重現(xiàn)性，結(jié)果見表9。

由表9可知，小兒感冒顆粒微生物限度檢查：細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法采用常規(guī)法（1mL／皿）、控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）檢查方法采用常規(guī)法（100mL／瓶、10mL／支）檢查，符合《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，方法可行。但也存在一些問題：（該產(chǎn)品含有生藥原粉，采用常規(guī)法檢查，菌落計數(shù)時有的菌落易與藥材細粉混淆，而加入TTC（氯化三苯四氮唑試液），使菌落與TTC作用后變紅，可解決這一問題，但TTC對枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用。（因有藥材原粉，碰到樣品本底含菌量較多時，驗證比較麻煩，需消除或減少樣品本身所含有的菌，才能方便檢驗，有待于進一步完善提高。中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

表9 小兒感冒顆粒微生物限度檢查結(jié)果

［3］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京：科學出版社，2000.

Microbial limit test method development and validation for Xiao＇er Ganmao Granules

WEI Yong－pu，JIANG Qiu－xiang
Liuzhou food and drug control in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Liuzhou 545006，China

ObjectiveTo establish microbial limit test method for Xiao＇er Ganmao Granules.Methodsaccording to microbial limit test method in Chinese Pharmacopoeia（2010 edition，VolumeⅠ）for verification test.Result Bacterial count、Mold count and Yeast count test by microbial limit test method of Xiao＇er Ganmao Granules could be verify by conventional method（1mL／vessel），the recovery rate（%）in trial group are not less than 70%；escherichia coli for check method of control bacterias（escherichia coli group、Coliform），adopt conventional method（100mL／flask、10mL／flask）to do the verification test，trial group、positive control group detected escherichia coli，negative control group have no bacterium.ConclusionBacterial count、Mold count and Yeast count test by microbial limit test method of Xiao＇er Ganmao Granules can adopt conventional method（1mL／vessel），check method of control bacterias（escherichia coli group、Coliform）can adopt conventional method（100mL／flask、10mL／flask）.

Xiao＇er Ganmao Granules；microbial limit test method

R963

A

1007－8517（2013）16－0030－04

2013.06.01）

韋永樸男，壯族，藥學中級，主要從事食品藥品微生物檢驗工作。E－mail：weiyongpu2013＠sina.cn