益肺通絡顆粒的主要藥效學研究

歐 艷，楊 勵，左亞杰，曾建國，劉艷科

（1.長沙市中心醫院，湖南 長沙410004；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410002）

結核病是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染，每年新出現結核病患者約800～1 000萬[1]，每年因結核病死亡人數約為200～300萬。據世界衛生組織(WHO)報道，全球結核病總耐藥率為20.0%，耐多藥率為5.3%，估計全球耐多藥結核病已達50萬例[2-3]。我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病的14.3%，居世界第2位，其中肺結核患者耐多藥率為6.8%。

益肺通絡顆粒是我院中醫專家劉艷科教授的經驗方，國家“十一五”科技重大專項研究—中醫藥治療肺結核臨床科研基地建設的基礎研究中的自擬處方(“益肺通絡方”已申請處方專利，發文序號2011041400413580)，由黃精、白及、太子參、百部、矮地茶、紫花地丁、大薊等11味藥組成，具有益氣養陰、化瘀通絡、去腐生新的功效，主治氣陰兩虛夾瘀型耐多藥肺結核。本文參考《中藥新藥研究指南》[4]的要求及相關實驗方法[5]，對益肺通絡顆粒進行了抗結核、抑制超敏、增強免疫及止咳等方面的研究，旨在為其臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 小白鼠，昆明種，SPF級，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號：HNASLKJ20102986。

1.1.2 藥物 益肺通絡顆粒（湖南中醫藥大學附屬第一醫院制劑室提供，批號：20110625，生藥含量：3.13 g生藥/g，成人日用量：75.12 g生藥/d）；異煙肼片 （0.1 g/片，山西云鵬制藥有限公司，批號：100402）；鹽酸左旋咪唑片（25 mg/片，南京白敬宇制藥廠，批號：100101）；枸櫞酸噴托維林片（25 mg/片，河南省安陽市第一制藥廠，批號：100502）。強毒人型結核菌（H37RV）菌株，中國疾病預防控制中心；2，4-二硝基氯苯（安徽八一化工股份有限公司，醫藥級，批號：093356）；印度墨汁（北京篤信精細制劑廠，批號：0040823）；濃氨水（南寧第二化工廠，批號：091023）。

1.1.3 儀器 721分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.1.4 藥物配制方法和實驗動物分組 各藥物均臨用前用蒸餾水配制成所需濃度的混懸藥液。益肺通絡組低、中、高劑量分別為含生藥6、12、24 g/kg。實驗動物隨機分為6組：第1組為正常對照組，第2組為模型對照組，灌胃給等體積蒸餾水；第3、4、5組分別為益肺通絡低、中、高劑量組；第6組為陽性藥物組；或5組：空白對照組，灌胃給等體積蒸餾水；益肺通絡低、中、高劑量組；陽性藥物組。每組動物12只，給藥體積：20 mL/kg，均灌胃給藥。

1.2 方法

1.2.1 對結核桿菌感染動物的治療作用 參考文獻方法[6]，取健康昆明種小鼠72只，雌雄各半，體質量（17.1±0.6）g。適應環境后，按性別、體質量分層，隨機分為6組，每組12只。除空白對照組小鼠外，其他各組小鼠尾靜脈注射接種2 mg/mL人型結核桿菌（H37RV）0.2 mL/只。感染后第3日，各組灌胃給藥，異煙肼組給予0.75 g/kg異煙肼片，連續3 d。連續3周觀察各組小鼠死亡情況，計算各組小鼠的生存時間，稱量肺、肝、脾質量，測算肺、肝、脾臟器指數，臟器指數（mg/g）=臟器質量（mg）/體質量（g）。

1.2.2 對遲發型超敏反應的影響 參考文獻方法[7]，取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質量（20.0±1.2）g。小鼠腹部剪毛約4 cm2，適應環境后，按性別、體質量分層，隨機分為5組，每組12只。連續給藥10 d，陽性藥物組為0.75 g/kg鹽酸左旋咪唑片。給藥第4天，將1%2，4-二硝基氯苯50μL均勻涂抹于腹部去毛部位，給藥第9天，將1%2，4-二硝基氯苯10μL均勻涂抹于小鼠右耳雙面進行攻擊，攻擊后24 h，處死，用直徑8 mm的打孔器取下雙側耳片(取對稱位置)，分別稱其質量，以兩耳片質量之差作為腫脹度。

1.2.3 對正常小鼠非特異性免疫功能的影響 參考文獻方法[8]155，取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質量（20.2±1.4）g。適應環境后，按性別、體重分層，隨機分為5組，每組12只。連續灌胃給藥10 d，陽性藥物組為0.75 g/kg鹽酸左旋咪唑。末次給藥30 min后，稱取體質量，尾靜脈注射印度墨汁0.1 mL/10 g，注射后2 min（t2min）、20 min(t20min)分別從眼眶后靜脈叢采血20μL，溶于2 mL，0.1%Na2C03溶液中搖勻，在波長610 nm下比色，測定光密度（以下分別用OD2min和OD20min來表示2 min和20 min所取血樣的光密度）。取血完畢，用頸椎脫臼法處死小鼠，取其肝臟、脾臟，稱質量。按下列公式計算廓清指數（K）及校正廓清指數（α）進行統計學計算。

1.2.4 對小鼠氨水引咳試驗的影響 參考文獻方法[8]424，取健康昆明種小鼠足量，禁食不禁水12 h，置于500 mL燒杯中，在直徑小于燒杯的表面皿內放一棉球，上面加蓋篩網，向棉球中注入0.4 mL氨水（25%），迅速將燒杯倒置，使得氨水刺激小鼠引發咳嗽，以小鼠腹肌強烈收縮，同時張嘴呼氣為準。以1 min內咳嗽次數大于或等于3次判定為引咳初篩合格。

取上述引咳初篩合格的小鼠60只，雌雄各半，體質量（20.1±1.2）g。按性別、體質量分層，隨機分為5組，每組12只。連續灌胃給藥10 d，陽性藥物組為50 mg/kg枸櫞酸噴托維林片。末次給藥后30 min，依照上法以氨水刺激小鼠引發咳嗽。觀察并記錄各組小鼠引咳潛伏期（從倒置燒杯至發生咳嗽的時間），以及小鼠3 min內咳嗽次數，3 min內不咳者潛伏期以3 min計。

1.3 統計學分析

所有資料應用SPSS 16.0統計軟件進行統計處理，采用“±s”表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 對結核桿菌感染動物死亡時間的影響

小鼠死亡時間觀察結果顯示，模型對照組小鼠感染人型結核桿菌（H37RV）后第15天開始出現死亡，至第23天實驗結束時僅有1只小鼠存活。益肺通絡顆粒不同劑量組小鼠存活時間均高于模型對照組，存活率分別達到16.7%、50.0%、83.3%，對人型結核桿菌（H37RV）感染小鼠具有明顯的保護作用，且存在劑量等效關系。結果見表1。

表1 益肺通絡顆粒對結核桿菌感染小鼠死亡時間的影響

2.2 對結核桿菌感染小鼠臟器指數的影響

各組小鼠肺、肝、脾臟器指數測算結果顯示，小鼠感染人型結核桿菌（H37RV）后，肺、肝、脾臟器重量顯著增加（P＜0.01），中、高劑量益肺通絡顆粒對感染小鼠肺、肝、脾臟器均存在顯著的保護作用（P＜0.01）。結果見表2。

表2 益肺通絡顆粒對結核桿菌感染小鼠臟器指數的影響（±s）

表2 益肺通絡顆粒對結核桿菌感染小鼠臟器指數的影響（±s）

注：與空白對照組比較##P＜0.01；與模型對照組比較**P＜0.01。

劑量（g/kg）組 別空白對照組模型對照組益肺通絡低組益肺通絡中組益肺通絡高組異煙肼組——6 12 24 0.75例數12 12 12 12 12 12肺臟指數5.24±0.66 8.82±0.82##8.67±0.56 8.01±0.65**7.31±0.35**7.11±1.16**肝臟指數5.13±0.81 8.29±0.75##8.06±0.85 7.43±1.03**6.49±0.86**7.13±1.10**脾臟指數0.37±0.07 0.52±0.09##0.48±0.06 0.43±0.10**0.36±0.07**0.37±0.05**

2.3 對遲發型超敏反應的影響

與模型組比較，中、高劑量益肺通絡顆粒對小鼠耳腫脹度有顯著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），說明其對小鼠遲發型超敏反應有較好的抑制作用。結果見表3。

表3 益肺通絡顆粒對小鼠耳腫脹度的影響 （±s）

表3 益肺通絡顆粒對小鼠耳腫脹度的影響 （±s）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別模型組益肺通絡低組益肺通絡中組益肺通絡高組左旋咪唑組劑量（g/kg）—6 12 24 0.75例數12 12 12 12 12腫脹度（mg）4.3±0.90 3.7±1.16 3.2±1.14*2.6±0.84**2.8±1.38**

2.4 對正常小鼠非特異性免疫功能的影響

與空白組比較，中、高劑量益肺通絡顆粒小鼠炭粒廓清指數和校正廓清指數均顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明益肺通絡顆粒能顯著增強小鼠的非特異性免疫功能。結果見表4。

表4 益肺通絡顆粒對小鼠炭粒廓清速率的影響 （±s）

表4 益肺通絡顆粒對小鼠炭粒廓清速率的影響 （±s）

注：與空白對照組比較**P＜0.01。

組 別空白對照組益肺通絡低組益肺通絡中組益肺通絡高組左旋咪唑組劑量（g/kg）—6 12 24 0.75例數12 12 12 12 12廓清指數(k，×10-2)1.87±0.27 2.12±0.37 2.74±0.68**2.96±0.42**2.89±0.53**校正廓清指數(α)4.59±0.34 5.06±0.81 5.88±1.34**6.16±1.07**6.26±0.75**

2.5 對小鼠氨水引咳試驗的影響

與模型組比較，中、高劑量益肺通絡顆粒能顯著延長小鼠氨水引咳的潛伏期（P＜0.05，P＜0.01），減少3 min內咳嗽次數（P＜0.05，P＜0.01），說明益肺通絡顆粒具有較好的止咳作用。結果見表5。

表5 益肺通絡顆粒對小鼠咳嗽次數的影響 （±s）

表5 益肺通絡顆粒對小鼠咳嗽次數的影響 （±s）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別模型組益肺通絡低組益肺通絡中組益肺通絡高組左旋咪唑組劑量（g/kg）—6 12 24 0.75例數12 12 12 12 12引咳潛伏期(s)35.5±7.7 40.3±6.7 43.1±9.8*46.9±9.4**49.2±10.0**3 min咳嗽次數30.8±7.6 28.8±6.5 23.4±6.9*18.1±4.4**14.8±8.9**

3 討論

臨床研究和藥理實驗研究證明，很多單味中藥本身就有不同程度的抗結核桿菌作用，如貓爪草、苦參、大蒜、狼毒、水車前、夏枯草、白及、百部、黃連、黃芩、蒼術、淫羊藿、遠志、北豆根、龍舌草、黃芪、冬蟲夏草、葎草等[9-11]。“益肺通絡方”以黃精、白及、太子參為方中主藥，黃精補中益氣、潤心肺、強筋骨，白及收斂止血、消腫生肌、補肺，太子參補益脾肺、益氣生津，現代藥理研究表明三藥對結核桿菌有抑菌作用，且黃精有增強免疫功能、抗衰老、抗疲勞、耐缺氧作用，尤擅長于肺結核治療，體外試驗其對結核桿菌有明顯抑制作用。百部、矮地茶、紫花地丁、大薊化痰、殺蟲、消瘀、生新；天冬、款冬花、鱉甲清潤肺氣、滋陰軟堅、增強免疫；絲瓜絡通經絡、和血脈、化痰順氣。上述諸藥合用，共奏滋陰潤肺、殺蟲祛痰、化瘀生新之功。

研究報道中西藥結合在控制肺結核臨床癥狀(如咯血、咳嗽、發熱)[12-13]、促進病灶吸收[14]、提高涂陽肺結核的轉陰率[15]等方面比單用化療藥物效果好。另外，中西藥結合能明顯降低化療藥物的毒副作用，減輕肝功能損傷，防止血尿酸升高，提高患者的順應性。對于耐藥性肺結核的治療，中西醫結合也常可取得很好的療效[15-16]。臨床研究報道[17]“益肺通絡方”聯合化療藥物治療耐多藥肺結核在促進痰結核分枝桿菌陰轉率、肺部病灶吸收有效率均優于單純西藥組，強化期影像學上均有不同程度的好轉與吸收，藥物不良反應較輕，患者可以耐受。可用于肺結核病Ⅲ型繼發性肺結核（浸潤性、慢性纖維空洞型）病，配合西藥化療減毒增效，減少耐藥性，增強抗結核作用。

本實驗結果表明，益肺通絡顆粒對人型結核桿菌（H37RV）感染小鼠具有顯著的保護作用，對氨水引起的小鼠咳嗽有顯著的抑制作用。同時，能顯著抑制小鼠遲發型超敏反應，增強小鼠的非特異性免疫功能。為有效控制益肺通絡顆粒的質量，通過研究建立了益肺通絡顆粒的質量控制方法，采用薄層色譜對黃精、紫花地丁和百部進行定性鑒別，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；采用高效液相色譜(HPLC)法對矮地茶中主要成分巖白菜素進行含量測定，含巖白菜素不少于1.25 mg/g[18]。

從益肺通絡顆粒組方藥物的文獻資料來看，該方重在益氣養陰、祛瘀通絡、化痰止咳，對機體免疫功能有一定的增強作用。針對該方的藥效學試驗主要在驗證其對于機體免疫功能的影響，止咳效果，以及其對于結核桿菌損害機體的保護作用，而沒有進行該藥體內抑菌作用的詳細觀察，所以第一項實驗僅設計3 d給藥，給藥時間過短，且未進行臟器活菌檢查以及肺臟病理學檢查，僅從動物存活數和臟器指數觀察了益氣通絡顆粒對于結核桿菌損害的保護作用。但該藥體外試驗顯示有明顯抑制結核分枝桿菌作用，且尤對耐多藥結核分枝桿菌敏感[19]，是否可設計活菌培養計數法判斷結核菌是否存活以及結核菌感染小鼠感染治療作用的評價：肺組織勻漿培養；注射部位皮下結節、破潰；遲發性過敏反應或肺、肝、脾感染結核桿菌的病理表現等，來驗證益肺通絡顆粒抗結核作用，有待以后的研究證實。

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