眼部不同方式注射川芎嗪抑制小鼠視網膜新生血管形成的比較研究

易細香，徐 敏，傅 培

（北京大學深圳醫院眼科，廣東 深圳518036）

視網膜新生血管形成，是糖尿病視網膜病變、眼底血管栓塞、缺血性眼病等最終導致視力喪失的重要原因，迄今尚無有效的治療方法。川芎嗪在改善血液流變學異常、改善微循環方面有一定優勢。穴位注射是傳統的針灸療法與現代的注射、封閉方法相結合的有效而無副作用的治療方法。本文從形態學、分子生物學方面探討川芎嗪對視網膜新生血管形成的干預作用，并探討安全有效、無創的局部給藥途徑，為治療血管源性眼病開辟新的給藥途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 出生后第7天的健康C57BL／6J幼鼠90只，雌雄不限，未斷奶與哺乳母鼠共同飼養，廣州動物實驗室提供，動物合格證號：0097634。

1.1.2 儀器 電腦氧氣濃度控制儀(產地青島，型號MBKY-2F)、光學顯微鏡（德國Leica DM4000B）。

1.1.3 試藥 鹽酸川芎嗪注射液(20 mg／mL)，常州制藥廠生產，批號：001002。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 參考Smith等[1]和張正培等[2]的方法建立氧誘導的血管增生性視網膜病變幼鼠模型，取健康幼鼠C57BL/6J 90只，隨機分為正常對照組，模型對照組（A組）、太陽穴穴位注射組（B組）、睛明穴穴位注射組（C組）、玻璃體腔注射組（D組）、鼠尾靜脈注射組（E組），每組15只，與哺乳母鼠一起置于干燥密閉玻璃容器內，提供足夠的食物及水。除正常組外，其他組予以持續高氧混合氣體(75%氧氣和25%氮氣)，在此高氧環境中飼養5 d后將幼鼠取出，回到正常空氣環境下飼養養，建立氧誘導視網膜新生血管病變幼鼠模型。

1.2.2 給藥方法 根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的實驗動物針灸圖譜取穴，B組、C組分別取小鼠太陽穴、睛明穴，針1～3 mm，推藥前捻轉刺激后用裝有川芎嗪注射液的微量注射器，推藥0.02 mL，(含川芎嗪0.4 mg)，每日1次，連續7 d；D組玻璃體腔注射川芎嗪注射液0.01 mL(含川芎嗪0.2 mg)，E組鼠尾靜脈注射川芎嗪0.02 mL(含川芎嗪0.4 mg)，每日1次，連續給藥7 d；正常組與模型對照組每天鼠尾靜脈注射等容積生理鹽水0.02 mL，每日1次，連續給藥7 d。

1.2.3 視網膜新生血管細胞核計數 治療結束5 d后所有小鼠頸椎脫臼處死，取出右眼，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水、透明、浸蠟、切片。采用厚度為6μm的連續切片，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位平面。常規蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察結果。每只眼球間斷取10個病理不含視乳頭切片，相鄰兩個切片間隔60μm(10個切片)，計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數目，統計平均每只眼球每張切片突破內界膜的血管內皮細胞核數。

1.2.4 動物血清血管內皮生長因子（VEGF）含量測定 小鼠處死后眼球采血。采用雙抗體夾心法測定血清血管內皮細胞生長因子含量，操作方法按說明書進行。

1.3 統計學分析

2 結果

1.1 視網膜新生血管內皮細胞核數

正常對照組15眼有5眼見極少數突破內界膜的視網膜血管芽，其細胞核數為1～10個，其余10眼均未見視網膜新生血管芽；其余組均可見視網膜新生血管芽，發生率為100%。A組（130.83±41.63）個與正常對照組（6.56±3.41）比較（P＜0.01），差異有統計學意義，說明造模成功。B、C、D、E組均低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；B組分別與D組、E組比較，D組與E組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；C組分別與B組、D組、E組比較，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠視網膜新生血管芽細胞核數 （±s，n=15）

表1 各組小鼠視網膜新生血管芽細胞核數 （±s，n=15）

注：與模型對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與睛明穴注射組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別 給藥劑量(mg/只)血管內皮細胞核數目（個）血清VEGF含量(mg/L正常對照組 — 6.56±3.41# 9.28±1.26#A組 — 130.83±41.63** 18.31±4.33**B組 0.40 68.39±32.07*# 13.35±2.41*##C組 0.04 75.23±27.12# 15.25±3.37##D組 0.02 58.56±36.21*# 12.32±2.53*#E組 0.04 59.39±21.78*# 12.37±3.11*##)

2.2 各組血清VEGF含量

B、C、D、E組均低于A組，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），說明川芎嗪能有效抑制氧誘導小鼠VEGF形成；B組分別與D組、E組比較，D組與E組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；C組分別與B組、D組、E組比較，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

3 討論

大量研究表明，缺氧是導致視網膜新生血管形成的主要刺激因素，將生后1周內C57BL／6J幼鼠置于75%濃度的氧環境中連續生活5 d，回到正常空氣環境下飼養，即可見大量的視網膜新生血管形成[1]，先是高氧階段的血管閉塞和消失，正常發育中的視網膜血管停止生長，然后是進入空氣相對低氧的環境下，導致了在缺氧狀態下的視網膜血管異常增殖。缺氧可促進VEGF的合成[3]，受缺氧調節的特性使其成為最重要的促新生血管形成因子，參與缺氧誘導有關的眼內新生血管形成[4]。本文通過視網膜新生血管芽細胞核計數來判斷視網膜新生血管的增殖程度，新生血管芽細胞核數越多表明視網膜新生血管增殖越嚴重。本實驗結果顯示造模成功。

中藥川芎含有川芎嗪、阿魏酸鈉、川芎內酯等化學成分，川芎嗪是其主要有效活性成分。川芎嗪有較強的擴張微血管、改善微循環、降低血黏度、改善血液流變、降低毛細血管通透性、調節血小板功能和抗凝作用。川芎嗪對糖基化終產物(AGEs)誘導的人視網膜色素上皮細胞產生VEGF具有抑制作用[5]；可通過抑制DNA合成來抑制成纖維細胞的增殖[6]；倪峰[7]研究說明經絡穴位對藥物有快速吸收和放大的效應。穴位注射藥效具有高效性與速效性；具有穴效藥效“迭加效應”，能減少用藥量，提高療效，是一種簡易而又有效的眼局部治療方法。睛明穴與太陽穴位于眼周，為眼部穴位注射常用穴位。玻璃體腔注藥抗VEGF治療近年臨床應用較多，但玻璃體腔注藥為有創操作，術后并發癥較多。蔡東梅通過雙側針刺糖尿病視網膜病變大鼠睛明、太陽等穴，電鏡觀察大鼠微血管病變得到顯著改善[8]。

本實驗結果表明，應用川芎嗪后，各注射組與靜脈注藥組小鼠血清VEGF含量明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），而且治療組視網膜新生血管細胞核數目較模型組明顯減少，組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），這一結果表明川芎嗪能有效抑制視網膜新生血管細胞形成、具有抗血清VEGF作用，說明川芎嗪對視網膜新生血管增殖具有抑制作用；川芎嗪太陽穴注射組與玻璃體腔注射組、靜脈給藥組間比較，小鼠血清VEGF含量、小鼠視網膜新生血管芽數目差異無統計學意義，說明川芎嗪太陽穴穴位注射與玻璃體腔注射、靜脈給藥療效相當；睛明穴穴位注射組與玻璃體腔注射組、靜脈給藥組間比較，小鼠血清VEGF含量、小鼠視網膜新生血管芽數目差異有統計學意義（P＜0.05），說明川芎嗪睛明穴穴位注射療效不如玻璃體腔注射、靜脈給藥途徑；川芎嗪太陽穴注射組與睛明穴穴位注射組療效比較，睛明穴穴位注射組小鼠視網膜新生血管細胞形成數目與血清VEGF均高于太陽穴注射組（P＜0.05），說明睛明穴穴位注射組療效不如太陽穴注射，太陽穴注射療效更佳。

太陽穴位于顳淺動脈旁，顳淺動脈旁注射復方樟柳堿治療缺血性眼底病在臨床廣泛應用[9-10]，其機制是通過顳淺動脈旁的自主神經末梢使脈絡膜血管活性物質維持正常水平，增加眼血流量，有助于解除脈絡膜血管痙攣，恢復脈絡膜血管正常舒縮功能促進側支循環的建立，減輕脈絡膜缺血所導致的視神經、視網膜缺血的病理改變，由于其簡單易行而被廣泛采用。

視網膜新生血管增殖的中藥治療目前尚處于初期研究階段，川芎嗪給藥新方式如球周穴位注射、玻璃體腔注射，新劑型的開發如膏藥穴位敷貼等，均具有很好的研究和應用前景。本實驗玻璃體腔注射微量川芎嗪，無一例發生眼內炎，但璃體腔注射為有創操作，其安全性需進一步研究，川芎嗪太陽穴穴位注射療效同玻璃體腔注射，安全，療效確切，為局部無創治療的最佳選擇，本實驗為治療血管源性眼病開辟新的安全有效、簡便實用給藥途徑提供實驗依據。

[1]Smith Lois EH，W esolowski E，Mciellan A，et a1.Oxygeninduced retinopathy in the mouse[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(1)：101-111.

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[3]Nomura M，Yamagishi S，Harada S，et al.Possible Participationof autocrine and paracrine vascular en dothelial growthfactors in hypoxia-induced proliferation of endothelial cellsand pericytes[J].J Biol Chem，1995，270(47)：28 316-28 324.

[4]周洪偉，關 強.血管內皮生長因子及其受體與眼底新生血管[J].國際眼科雜志，2007，7(3)：791-795.

[5]陳忠平，姜德詠.川芎嗪對糖基化終產物誘導人視網膜色素上皮細胞表達血管內皮生長因子的影響[J].中國現代醫學雜志，2007，17(16)：1 945-1 949.

[6]陳學忠.川芎嗪、丹參對體外培養成纖維細胞的作用[J].中西醫結合雜志，1987，7(9)：541-543.

[7]倪 峰，林靜瑜，周春權，等.穴位注射療法作用機制探討[J].中國針灸，2003，23(10)：609-611.

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[9]宋 琛.缺血性眼病治療新概念[M].北京：人民軍醫出版社，2005：84，90，97.

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