RP HPLC法同時(shí)測(cè)多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度

翁愛(ài)彬，方劍英，鄭荔莉

（福建省莆田學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，福建 莆田351100）

多索茶堿為甲基黃嘌呤的衍生物，其有效血藥濃度范圍為10～20 μg/mL，它可直接對(duì)支氣管起作用，為支氣管擴(kuò)張劑的一種，能有效地松弛支氣管平滑肌。臨床上，患者服用多索茶堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究已經(jīng)有了相關(guān)的報(bào)道[1-3]，對(duì)患有嚴(yán)重肝功能損害或伴隨喹諾酮類藥物治療的患者應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且在多索茶堿的說(shuō)明書中也要求應(yīng)視個(gè)體病情的變化來(lái)選擇使用最佳用藥的劑量和用藥的方法，同時(shí)進(jìn)行血藥濃度的監(jiān)測(cè)。多索茶堿的血藥濃度測(cè)定方法有高效薄層色譜法和光密度掃描法及HPLC法。

最常用的抗癲癇藥為苯巴比妥（有效血藥濃度范圍：10～40 μg/mL）、苯妥英鈉（有效血藥濃度范圍：10～20 μg/m L）、卡馬西平（有效血藥濃度范圍：4～12 μg/mL）。因這3種抗癲癇藥物的有效血藥濃度范圍較窄，患者之間個(gè)體差異較大，抗癲癇作用和毒性與在體內(nèi)的血藥濃度有很大的相關(guān)性，同時(shí)，癲癇治療需要長(zhǎng)期的用藥，因此，服用抗癲癇藥物后須要進(jìn)行血藥濃度的監(jiān)測(cè)和個(gè)體化給藥[4]。高效液相色譜法（HPLC）、熒光偏振法（FPIA）及酶增強(qiáng)免疫法（EMIT）是抗癲癇藥物常用的監(jiān)測(cè)方法。

人血清中茶堿及3種抗癲癇藥濃度的同時(shí)測(cè)定已有相關(guān)的報(bào)道[5-7]，而多索茶堿及抗癲癇藥在血清中的藥物濃度同時(shí)測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，所以筆者建立了能夠同時(shí)測(cè)多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度的反相高效液相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀（包括二元梯度泵、LCsolution工作站、SPD-20A型紫外檢測(cè)器）；KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XK-80A快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；TDL80-2B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BT25S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

1.2 試劑

多索茶堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：100625-200301）、苯妥英鈉對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：100210-201002）、苯巴比妥對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：171222-200605）、卡馬西平對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：100142-199503）；重蒸餾水；甲醇為色譜純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及色譜圖

色譜柱為ODS-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），柱溫20 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水（50：50），流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL。空白血清的色譜圖見(jiàn)圖1，空白血清加對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖2。由圖1和圖2可知4種藥物分離良好，且不受血清雜質(zhì)干擾，4種藥物的保留時(shí)間依次為多索茶堿3.718 min、苯巴比妥6.691 min、苯妥英鈉12.308 min、卡馬西平14.138 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

圖1 空白血清色譜圖

圖2 空白血清加對(duì)照品色譜圖

分別精密稱取多索茶堿、苯妥英鈉、苯巴比妥對(duì)照品各6.25 mg，卡馬西平對(duì)照品2.5 mg于25 mL容量瓶中用甲醇溶解稀釋至刻度，配制成含多索茶堿、苯妥英鈉、苯巴比妥各250 μg/mL，卡馬西平100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再分別精密量取多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0 mL于5 mL的容量瓶中，配制成含多索茶堿12.5、25.0、37.5、50.0、75.0、87.5、100.0、125.0、150.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0 mL于5 mL的容量瓶中，配制成含苯妥英鈉12.5、25.0、37.5、50.0、75.0、87.5、100.0、125.0、150.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL于5 mL的容量瓶中，配制成含苯巴比妥12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0、200.0、250.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL于5 mL的容量瓶中,配制成含卡馬西平5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 樣品處理

精密量取血清0.2 mL，加甲醇0.8 mL混合，渦旋提取1 min，4 000 r/min離心10 min，取上層清液過(guò)濾，進(jìn)樣20 μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取血清0.2 mL，加入不同濃度多索茶堿、苯妥英鈉、苯巴比妥和卡馬西平的標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL，配制成不同質(zhì)量濃度梯度（分別含多索茶堿2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、17.5、20.0、25.0、30.0 μg/mL，苯妥英鈉2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、17.5、20.0、25.0、30.0 μg/mL，苯巴比妥2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL，卡馬西平1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL）的血清樣品共9管，渦旋提取1 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行過(guò)濾，最后進(jìn)樣20 μL。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程。以樣品SNR（S：N）為3：1作為最小檢測(cè)信號(hào)。各對(duì)照品的回歸方程、線性范圍、最低檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 方法回收率試驗(yàn)

在血清中加入一定量的多索茶堿、苯巴比妥、卡馬西平和苯妥英鈉4種藥物的對(duì)照品，制成低、中、高3種濃度的血清樣品，然后進(jìn)行血清樣品處理，進(jìn)樣20 μL，根據(jù)所得圖形峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品濃度，求得的樣品濃度與理論的樣品濃度之比，即為方法回收率。見(jiàn)表2。

2.6 精密度RSD檢測(cè)

在血清中加入一定量的被測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品，制成低、中、高3種濃度的血清樣品各5份，在一天之內(nèi)連續(xù)測(cè)5次計(jì)算日內(nèi)精密度，以后連續(xù)5 d每天測(cè)1次計(jì)算日間精密度。見(jiàn)表2。

3 討論

如今聯(lián)合用藥的情況越來(lái)越多，藥物之間的相互作用和藥物的治療范圍被越來(lái)越多的人重視，因此，采用反相高效液相色譜法分離藥物，對(duì)藥物進(jìn)行監(jiān)測(cè)也得到了廣泛應(yīng)用，反相高效液相色譜法不再只是單一分離同類藥物從而進(jìn)行監(jiān)測(cè)，也可以是不同類別的藥物進(jìn)行梯度洗脫從而分離。

表1 4種藥物的回歸方程

表2 回收率及精密度結(jié)果（n=5，%）

苯巴比妥、苯妥英鈉和卡馬西平這3種藥物采用高效液相色譜法測(cè)定時(shí)，大多采用互為內(nèi)標(biāo)，但是如果要同時(shí)測(cè)定這3種抗癲癇藥物的濃度時(shí)則多有不便，因此應(yīng)建立適宜的同時(shí)測(cè)定該3種藥物的方法，不僅可以迅速測(cè)定血樣，而且節(jié)省了試劑。為符合上述要求，建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度，讓其更適合臨床使用。

本方法被測(cè)藥物的檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，流動(dòng)相是甲醇-水：50：50，流速：0.8 mL/min，柱溫：20 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，同時(shí)測(cè)定多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度。

3.1 色譜條件的選擇

經(jīng)過(guò)檢測(cè)，多索茶堿、苯巴比妥、卡馬西平和苯妥英鈉這4種被測(cè)藥物的對(duì)照品能在210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處得到較強(qiáng)的響應(yīng)峰。而流動(dòng)相選擇甲醇-水，則是因其廉價(jià)易得，與乙腈等其他試劑相比較，其安全性較高，毒性較小；甲醇-水為中性試劑，對(duì)儀器以及色譜柱損害程度小[5]；有利于實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行。另外，在甲醇-水（50～60：40～50）中經(jīng)過(guò)摸索篩選選用50：50，在此比例下各峰得到較好分離，且峰形良好，雜質(zhì)峰較少。本實(shí)驗(yàn)采用的流動(dòng)相流速適中，柱溫相比于文獻(xiàn)中提到的室溫[8-9]、柱溫35 ℃[10]是比較低的，可以對(duì)色譜柱起到較好的保護(hù)作用，并且延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。

3.2 沉淀劑的選擇

在國(guó)外，檢測(cè)多索茶堿的血藥濃度采用反相高效液相色譜法，處理樣品的方法主要是固相提取法和血清直接進(jìn)樣法；而國(guó)內(nèi)在使用反相高效液相色譜法時(shí)，有些樣品處理是采用氯仿-異丙醇（4：1）提取法，這些方法都比較復(fù)雜，樣品經(jīng)預(yù)處理的時(shí)間較長(zhǎng)。

本方法中未用到文獻(xiàn)[7]中所提到的二氯甲烷來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，因二氯甲烷具有揮發(fā)性，沉淀后將其揮發(fā)所要的時(shí)間較長(zhǎng)，且要經(jīng)過(guò)流動(dòng)相復(fù)溶的步驟，操作繁瑣，直接用甲醇離心一次沉淀蛋白質(zhì)，然后取上清液進(jìn)樣20 μL，15 min之內(nèi)4種藥物均出峰，且各藥物響應(yīng)峰分離完全。該方法簡(jiǎn)便，所需時(shí)間較短，避免了操作費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。本研究建立的能同一時(shí)間測(cè)多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度的RP-HPLC法快速準(zhǔn)確，安全可靠，可用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

在檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相甲醇-水50：50，流速0.8 mL/min，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量20 μL的色譜條件下，采用反相高效液相色譜法能同一時(shí)間測(cè)定人血清中多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度。所需時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，儀器靈敏度高，專一性強(qiáng)，適合于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

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