三疣梭子蟹微衛星標記的篩選及特征分析

相 瑜，任麗平，王日昕

（浙江海洋學院海洋科學學院，浙江舟山 316022）

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus，屬于軟甲綱、十足目、梭子蟹科，分布于日本、朝鮮、馬來群島、紅海以及中國的廣西、廣東、福建、浙江、山東半島、渤海灣、遼東半島等地，生活環境為海水，常生活于10～30 m的沙泥或沙質海底。三疣梭子蟹肉多，脂膏肥滿，味鮮美，營養豐富。每百克蟹內含蛋白質14 g、脂肪2.6 g。鮮食以蒸食為主，還可鹽漬加工“槍蟹”、蟹醬，蟹卵經漂洗曬干即成為“蟹籽”，均是海味品中之上品。

由于三疣梭子蟹具有生長快、環境適應能力、強市場價格高和國內外價格穩定等特點使得各地三疣梭子蟹養殖不斷升溫，現已成繼對蝦、青蟹后又一重要養殖品種并被列為我國海洋水產養殖的重點對象[1-4]，取得了良好的社會和經濟效益。根據養殖設施的不同,梭子蟹養殖有池塘養殖、灘涂圍欄養殖、水泥池養殖和海區籠養等幾種方式。然而在養殖過程中出現諸多病蟲害如病毒病、真菌餅、寄生蟲類病以及養殖環境的惡化引起的各種養殖問題，關于三疣梭子蟹的種質資源分析與評估的研究已經開展，這些研究將為篩選及培育具有優勢生長性狀、抗病能力強、抗性良好的優良品種，保持三疣梭子蟹養殖業持續健康發展提供遺傳種質依據。

微衛星因為具有在基因組中廣泛分布、易于檢測等特性，因此微衛星分子標記技術在種質遺傳以及保護生物學領域得到了廣泛的應用。微衛星DNA(Microsatellite DNA)是指以少數幾個核苷酸(1～6個)為單位多次重復的簡單序列，因而也被稱為簡單序列重復(simple sequence repeats,SSR)[5]。因等位基因突變快、多態性高、雜合度高、信息含量豐富和呈孟德爾共顯性等顯著優點[6]，微衛星分子標記技術已經廣泛應用于例如人類、靈長類動物、農作物等連鎖群的構建和物理圖譜的繪制[7-9]。

目前，相關的分子標記技術已經被應用于三疣梭子蟹的種質資源保護的研究當中。微衛星標記也已經被應用到了三疣梭子蟹的資源保護領域，并在其種群遺傳結構分析等方面進行了相關應用[10-12]。但由于目前篩選得到的關于三疣梭子蟹的SSR標記的數量比較少，微衛星標記的缺乏已經對三疣梭子蟹的種質資源保護、遺傳圖譜構建及遺傳性狀等相關研究造成了障礙。為獲得大量的SSR分子標記，突破三疣梭子蟹相關遺傳和資源保護領域的研究瓶頸，本文利用5’錨定引物法篩選開發了一批新的微衛星標記，這樣既豐富了三疣梭子蟹的分子標記資源，也為進一步的三疣梭子蟹輔助育種提供必要的遺傳學理論支持。

1 材料和方法

1.1 基因組DNA提取

實驗所需三疣梭子蟹樣品采自舟山東門水產品市場。取兩只三疣梭子蟹腿部肌肉于1.5 mL離心管中，加入 300 μL 裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，1%SDS，pH 8.0)，將管足組織于離心管中充分剪碎，加入25 mg/ml蛋白酶K 10 μL，55℃水浴直到組織完全溶解。稍微冷卻后，加入300 μL飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，10 000 r/min離心10 min;取上清，重復抽提3次至上清液澄清；上清液中加入2倍體積的冰乙醇沉淀30 min。10 000 r/min離心10 min后用75%乙醇清洗2次，室溫晾干后溶于50 μl TE溶液，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量后于-20℃保存備用。

1.2 5’錨定引物擴增

實驗所用引物序列為P(CT)6=KKVRVRV(CT)6，K=G/T,V=G/C/A,R=G/A。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

將提取的2只三疣梭子蟹樣個體的DNA等體積混合作為模板，直接用錨定引物PCR擴增，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，利用TIANquick Midi Purification Kit試劑盒將300～1 000 bp大小的擴增片段回收純化，回收步驟參照試劑盒說明書。建立25 μL的PCR反應體系，其中包含1 μL混合DNA模板，1.5 μL 錨定引物，1.2 μL dNTP，1×buffer，1 U Taq酶。PCR 反應程序設定為：95 ℃預變性 5 min,然后95 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，7個循環；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；最終延伸10 min。

1.3 克隆及測序

建立 10 μL 的連接體系，包括 5 μL Solution I，4.5 μL 純化后的 PCR 產物，0.5 μL 的 pMD19-T vector(Takara)，16℃連接過夜。然后用DH5α大腸桿菌感受態細胞進行轉化，根據藍白斑篩選原則挑取平板上的單個菌落擴大培養。

利用M13系列通用引物對菌液進行陽性檢測，10 μL的PCR體系包含1 μL菌液，M13上下游引物各10 pM。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，隨機挑選300 bp以上的克隆子送到南京金斯瑞生物科技公司測序。

1.4 序列分析及統計

測序結果用Chromas軟件進行峰圖分析，DNAMAN去除重復序列，按照如下參數：一、二、三、四、五核苷酸，最低重復次數分別為12、6、3、3、3、3次，典型的雙核苷酸微衛星核心序列的最小長度為12 bp，以此標準搜索微衛星位點并進行統計。

2 結果

2.1 擴增條件篩選

錨定引物PCT分別在49℃、52℃、55℃、58℃四個退火溫度下進行擴增，結果顯示PCT引物在三疣梭子蟹基因組中55℃退火溫度下擴增效果最佳，凝膠電泳檢測結果如圖1所示。

2.2 序列分析及統計結果

對41個克隆子進行測序，其中35條序列含有微衛星位點，陽性克隆比率達到85.4%。去除重復序列后進行微衛星搜索并進行分類統計見表1，結果顯示共檢測到55個微衛星位點，分布于20條序列中，其中19條序列檢測到2個或2個以上微衛星位點。

在獲得的55個微衛星位點中，核心序列為(CT/AG)的微衛星位點有27個(50%)，除此之外還包含27個其他類型重復的微衛星(50%)，27個中多為三堿基或者4堿基重復，重復次數在3以上。對這些微衛星位點的重復類型進行統計，其統計結果如圖2所示。

圖1 PCT引物在三疣梭子蟹基因組中的擴增結果Fig.1 PCR profiles produced from genomic DNA.泳道 1為marker，泳道 2-5分別為49℃、52℃、55℃、58℃四個退火溫度下的擴增結果

表1 微衛星位點的搜索及統計結果Tab.1 Searching and statistics of microsatellite site

按照WEBER[13]提出的分類標準，微衛星可以分為三種類型即：P型、I型、C型。P型（完美型perfect)指沒有中斷的或附近無其它重復序列的重復序列，I型（非完美型imperfect)指2個或2個以上的同種重復序列，被3個堿基以下的非重復序列所間隔，C型（混合型compound)指一種重復序列與其它種類的重復序列被3個堿基以下的非重復序列所間隔。根據此分類標準，對該實驗中檢測到的微衛星位點進行位點特征分析，結果顯示：有2個位點屬于非完美型(3.70%)，未曾出現復合型，結果顯示見表2。

3 討論

圖2 微衛星標記的重復類型Fig.2 Repeat type of microsatellite markers I為非完美型微衛星位點

表2 微衛星序列的特征統計Tab.2 Characteristics Statistics of microsatellite markers

三疣梭子蟹由于其豐富的營養價值以及其味鮮等特性，已經逐漸成為水產養殖業重要的養殖對象。目前，三疣梭子蟹大規模人工養殖已經在中國沿海地區廣泛展開。由于三疣梭子蟹人工養殖親本主要來源于天然海捕親蟹,并未培育出適于人工養殖的新品種或新品系,因而近幾年在三疣梭子蟹人工養殖過程中頻頻出現諸如病害頻發、抗逆性差、性早熟等現象,嚴重制約了三疣梭子蟹人工養殖的健康發展[14-15]，這就促使廣大科研工作者要對三疣梭子蟹種質資源現狀開展研究分析。在分子標記研究方面，三疣梭子蟹的線粒體基因組已經獲得[16]，另外，一些學者也開發了一系列的微衛星分子標記并應用于親子鑒定及資源研究中[17-19]。

微衛星DNA首先由SKINNER等[20]在寄居蟹中發現，因其位點數量多、多態信息含量高、高重復性、孟德爾共顯性方式遺傳及檢測快速等優點被廣泛應用于遺傳學研究中。在微衛星標記的引物設計中微衛星序列的選取是關鍵的一步。目前得到微衛星序列的主要途徑主要有兩種即：一是通過構建富含微衛星的基因組文庫，進而雜交篩選出含有微衛星序列的陽性克隆，通過測序得到含有微衛星DNA的的片段序列；二是省略構建文庫，直接從數據庫中利用微衛星搜索軟件篩選含有微衛星DNA的序列信息，或是利用近緣物種的已知位點，這種方法省時有效，但受限于數據庫的資源量。構建文庫的方法中，普遍被使用的有FACSO方法和5’錨定法。5’錨定引物法是由FISHER等[21]發明，因高效率及快速等優點，被廣泛用于篩選微衛星標記。該方法是在一段少量重復序列的5’端添加幾個簡并堿基構成錨定引物，擴增兩個相鄰的特定微衛星位點及其之間的序列。5’錨定引物法有幾大優點：首先是避了免獲得的微衛星重復區域的側翼序列過短而導致不能用來設計特異引物；其次是可用于構建富含某特定位點的微衛星文庫；然后是在擴增特定位點的同時，可能會獲得其他類型的位點，因此每測一條序列即可獲得至少2個微衛星位點，具有較高的篩選效率。

BRENNER等[22]的研究表明，(CT)n類型的微衛星序列在動物個體中含量豐富，僅次于(CA)n重復，結合劉媛等[23]分析三疣梭子蟹EST序列微衛星分布的研究結果，本實驗采用PCT錨定引物，(CT)6的5’端加有簡并堿基KKVRVRV，其中VRVRV形成封閉，防止在擴增是引物在GA重復上發生滑動，確保擴增的多態的真實性。PCT錨定引物擴增的是相鄰的CT和AG重復類型的微衛星及其之間的序列。測序后得到的35條序列中，核心序列為(CT/AG)重復的微衛星有27個，占篩選總數的50%。該試驗采取錨定的方法，得到的（CT/AG）的重復類型的微衛星位點在所有的位點中數量上占絕對的優勢。因此從實驗結果可以看出，該錨定方法篩選三疣梭子蟹(CT/AG)類型的微衛星位點較成功。而且從微衛星類型上可以看出，三疣梭子蟹的微衛星類型很豐富，這也為接下來三疣梭子蟹的研究提供一定的理論依據。

本研究篩選的這些微衛星標記為三疣梭子蟹構建連鎖群及遺傳圖譜，開展種群遺傳結構分析，并對品種選育和種系評估提供了可靠的分子標記，也為進一步研究三疣梭子蟹的群體遺傳多樣性和群體結構打下堅實的理論基礎。

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