三磷酸腺苷發光法快速鑒定非結核分枝桿菌技術的研究

劉 君，裴 豪＊，徐志勤，徐 蘭

（1.無錫市第五人民醫院 檢驗科，江蘇 無錫214005；2.無錫市海規生物科技有限公司，江蘇 無錫214000）

分枝桿菌屬內除了結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外統稱為非結核分枝桿菌（NTM）。從AIDS開始流行后，非結核分枝桿菌感染才突然得到重視［1］，但是NTM發現的報道主要來源并非是結核高負擔的國家和地區，一些真正結核病流行的國家報道則很少見［2－4］。導致這一現象的主要原因在于結核病流行地區大多缺少鑒定非結核分枝桿菌的設備和技術，并且其他疾病對國家財政的壓力更大［1］。三磷酸腺苷發光法是通過裂解細菌并釋放活菌中的ATP，加入熒光素酶使之發光以判斷細菌活力的一種新型檢測方法，已在食品安全、微生物等方面廣泛應用［5］。本研究是利用三磷酸腺苷發光法檢測的原理來實現NTM的快速鑒定，以達到NTM的早期發現和減少漏檢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株：H37Rv（標準人型分枝桿菌）、堪薩斯分枝桿菌來源于江蘇省疾病控制中心。55例分離培養菌株來自無錫市第五人民醫院2012年1－6月收治入院的患者痰標本。

1.1.2 儀器和試劑：測定三磷酸腺苷發光法所用HygienaPI－102儀器、裂解液及熒光素酶和ATP發光檢測管由無錫市海規生物科技有限公司提供。LJ PNB法菌型鑒定培養管購自珠海貝索生物技術有限公司。Airstream R AⅡ型二級生物安全柜購自新加坡ESCO公司。XW－80旋渦混合器購自上海醫科大學儀器廠。LRHS－250－Ⅱ恒溫恒濕培養箱購自上海躍進醫療器械有限公司。PNB購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備：用接種環刮取適量L－J培養基斜面對數生長期的菌落于無菌磨菌瓶，加入1－2滴0.5%吐溫－80溶液和適量玻璃珠，用旋渦混合器振蕩然后加入0.85%NaCl制備成菌懸液，靜止約10min，待大顆粒菌團沉降后取上清液，用比濁儀調至1McF菌懸液。用無菌生理鹽水將1McF菌懸液稀釋為1∶100的菌液濃度備用。

1.2.2 PNB溶液的制備：稱取PNB粉250mg放入小型錐形瓶，加入4%氫氧化鈉1.5ml置37℃溶解，用檸檬酸調pH6.5－7.0后再加入無菌蒸餾水至25ml，應用液濃度為10mg／ml備用。

1.2.3 L－J PNB法菌型鑒定實驗操作：按照《臨床技術操作規范結核病分冊》操作［6］。

1.2.4 三磷酸腺苷發光法菌型鑒定實驗操作：在培養管中加入一定濃度的PNB溶液、培養液和1∶100稀釋的菌懸液0.5ml，生長對照管加入培養液和1∶100稀釋的菌懸液0.5ml。分別從鑒定管和生長對照管中取100μl溶液加入裂解液及熒光素酶，用HygienaPI－102檢測初始ATP讀數，將培養管放入恒溫恒濕培養箱培養并檢測其3、5和7天時鑒定管和生長對照管的ATP讀數。鑒定管中的ATP讀數變化大于初始讀數2倍以上表示耐藥，小于2倍則是敏感。

1.2.5 統計學方法：利用SPSS18.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 標準菌株（H37Rv）和堪薩斯分枝桿菌的最小抑菌濃度

經過試驗發現三磷酸腺苷發光檢測法中標準菌株的 MIC為50μg／ml（表1）。

表1 標準菌株在含PNB的ATP培養管中的生長情況

堪薩斯分枝桿菌在PNB濃度100－1500μg／ml的范圍內生長不受抑制（表2）。

表2 堪薩斯分枝桿菌在含PNB的ATP培養管中的生長情況

根據以上結果，我們以500μg／ml作為三磷酸腺苷發光法鑒定結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的PNB界限濃度。

2.2 臨床分離菌株L－J法和三磷酸腺苷發光法結果的比較

從實驗結果得出（表3）兩種方法的符合率為94.5%（52／55），在3株L－J法檢測為 NTM 而三磷酸腺苷發光法檢測為MTB的標本中，經分子生物學方法檢測，在有疑問的三株菌株中有兩株為NTM一株為MTB，其他52株菌株鑒定無誤。因此三磷酸腺苷發光法的準確率為98.2%（54／55），傳統L－J法的準確率為96.4%（53／55）。

對檢測時間進行比較，L－J法檢測從接種到有可見菌落長出的時間為17.87±5.73天，三磷酸腺苷發光法檢測時間為6.16±1.62天。三磷酸腺苷發光法檢測時間較L－J法明顯縮短，兩者比較有統計學差異（P＜0.001）。

表3 55例臨床菌株兩種方法的比較

3 討論

非結核分枝桿菌（Non－Tuberculous Mycobacteria，NTM）廣泛存在于土壤、水等自然環境中。有研究統計，在HIV陰性的NTM感染者中有46%的患者與農業有關［7］，這一現象與勞動中傷口接觸存在NTM的土壤和水源有直接關系。目前，非結核分枝桿菌的發現和報道主要來自于一些不是結核病高負擔的國家，而結核病流行的國家則少見報道，其主要原因在于結核流行的國家大多為發展中國家，缺少必要的檢測設備和方法。由于感染NTM的癥狀沒有特異性，和結核病感染的癥狀很相似，大多數時候僅僅根據痰檢找出抗酸桿菌就開始按照抗結核方案治療［8］，然而NTM對部分有時甚至全部抗結核藥物天然耐藥［9］，這將導致感染NTM的病人病情惡化，加重國家的負擔。因此，及時有效的區別NTM感染是十分必要的。

當前，實驗室區分非結核分枝桿菌的方法只要用L－J PNB法，該方法是根據PNB在500μg／ml的濃度下選擇性抑制結核分枝桿菌生長而對非結核分枝桿菌不抑制來做鑒定，一般需要28天才能給出報告。在本實驗中，即使對55例標本每天觀察培養管的生長情況也需17.87±5.73天的時間才能給出結果，這么長的報告時間必將會導致延誤治療甚至是錯誤治療。所有微生物體內都含有一定量的ATP，ATP與熒光素酶混合后能產生熒光，并且產生熒光的強度與ATP的含量成正比。三磷酸腺苷發光法是在傳統的PNB特性上融入了這一原理，在PNB培養管中如果有菌生長，則其ATP的含量將會越來越高，反之不生長，其ATP的含量則下降。三磷酸腺苷發光法是通過儀器檢測不需要肉眼識別，所以此方法在不增加檢測成本的情況下大大降低了檢測所需的時間（6.16±1.62天），減少人為判斷的誤差，可以更快更準確的給臨床提供結果，從而減少NTM感染病人的誤診和錯誤治療。

隨著AIDS的流行，NTM的感染也越來越多，人們對它的關注也越來越重視。三磷酸腺苷發光菌型鑒定法有著操作簡便、成本低且速度快等優點，在非結核分枝桿菌的實驗室診斷應用上存在巨大的潛力。

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［9］Griffith DE，Aksamit T，Brown－Elliott BA，et al.An official ATS／IDSA statement：diagnosis，treatment，and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，175：367.