母乳及嬰兒血液、尿液人巨細胞病毒DNA檢測在嬰兒HCMV感染中的應用

趙巍松，劉 伶，楊 飛

（馬鞍山市市立醫療集團 臨床檢驗中心，安徽 馬鞍山243000）

人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種雙鏈DNA病毒，屬于人類皰疹病毒，HCMV在自然人群中感染非常普遍，發達國家的感染率為30－70%，我國人群的感染率在80%以上［2］，一般表現為無癥狀的潛伏感染［3］。HCMV是引起先天性及圍生期感染的重要病原微生物之一，可通過胎盤、產道、母乳或血液直接傳播給嬰兒，導致死胎、流產、早產和生長發育遲緩及畸形等，嚴重影響胎兒的健康［4］，在免疫系統發育不完善的嬰兒及免疫缺陷者中可發生嚴重感染并可致死亡。該病毒可持續數年之久，對機體造成嚴重危害。據統計，在歐美新生兒HCMV先天感染率為0.2－2.2%，其中出生時即有癥狀者占10－15%，無癥狀的嬰兒中有10－15%遺留后遺癥，如智力遲緩、耳聾和視力損害。由于臨床表現缺乏特異性，實驗室建立快速、靈敏且特異的檢測技術對兒童HCMV感染的早期診斷與治療至關重要［5］。近年來發展起來并應用的各種檢測方法因有其各自的缺陷，尚不能完全滿足臨床早期、快速診斷的需要。本研究采用的熒光定量PCR（FQ－PCR）技術，是近年來發展起來的分子生物學領域中新一代檢測技術，具有簡便、快速、敏感度高等特點，是目前診斷HCMV感染的最敏感方法。我們通過對HCMV感染疑似患兒尿液、外周血白細胞以及與其配對的母乳進行巨細胞病毒核酸檢測，以研究母乳的傳染性和母嬰傳播率。

1 材料與方法

1.1 研究對象

106例來自2009年2月至2010年12月在我院收治的通過母乳喂養的疑似HCMV感染患兒和母親乳汁標本，年齡范圍在1天－12月嬰兒，納入標準參考1999年中華醫學會兒科分會制定的CMV感染診斷方案［6］。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 采集疑似患兒靜脈血，同時留取患兒新鮮尿液3ml于無菌的干燥管中。母乳采集用自我擠壓法（不用吸奶器），在清潔乳頭分數次擠出3－5ml乳汁入無菌管中，立即送檢。

1.2.2 標本處理 乳汁標本：充分混勻乳汁，然后吸取1.0ml置無菌離心管，12 000rpm／min，離心5 min棄上清及脂層，取沉淀。尿液標本：取1ml置于無菌管中，12 000rpm／min離心10min，棄上清，取沉淀。血液標本：EDTA抗凝血1ml，加淋巴細胞分離液分離白細胞。處理后的3種標本用試劑盒提取DNA模板，加入已配好反應體系的反應管。

1.2.3 試劑與儀器 HCMV核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒由中山大學達安基因診斷中心提供，引物序列為F5′－GCTAACTATGCAGAGCATGTA－3′，R5′－GCTGAGTTCTTGGTAAAGAAC－3′。儀器采用美國Perkin Elmer公司7300全自動PCR分析儀。

1.2.4 擴增條件 93℃2min預變性，然后按93℃45s→55℃60s，先做10個循環，最后按93℃30s→55℃45s，做30個循環。反應結束后電腦自動分析結果［7］。

1.3 診斷標準

（1）陰性結果判定：增長曲線不是典型的S曲線。（2）陽性結果判定：如果增長曲線呈典型的S曲線且HCMV－D N A＞1×103拷貝／ml。

1.4 統計方法

用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疑似HMCV感染患兒血、尿檢測結果比較

對106份血標本和尿標本進行了FQ－PCR檢測，其中，血液檢測中HCMV－DNA陽性的有47例占44.34%，尿液FQ－PCR檢測 HCMV－DNA 陽性61例占57.55%，兩種方法同時陽性的有35例占12.26%。兩種檢測方法比較，P＜0.05，兩種方法具有顯著差異。尿檢陽性率高于血檢。

2.2 106份母乳與配對患兒檢測結果比較

母乳檢測中HCMV－DNA陽性的有68例，陰性38例，陽性率為64.15%。其中，在患兒尿液HCMV－DNA陽性的61例中，配對的母乳陽性共54例，占88.5%（54／61），患兒尿液 HCMV－DNA陰性的45例中，配對母乳陽性共14例，占31.1%（14／45），兩者比較，P＜0.05，差異有顯著意義。在患兒血液HCMV－DNA陽性的47例中，配對的母乳陽性共36例，占76.6%（36／47），患兒血液 HCMV－DNA陰性的59例中，配對的母乳陽性共32例，占54.2%（32／59），兩者比較，P＜0.05，差異有統計學意義。見表1和表2。

表1 尿檢患兒及配對的母乳HCMV－NDA檢測結果

表2 血檢患兒及配對的母乳HCMV－NDA檢測結果

3 討論

HCMV在自然人群中感染普遍，多表現為亞臨床不顯性感染和潛伏感染?？砷L期間歇地從唾液、尿液、乳汁中排出，通過多途徑傳播。當免疫功能低下時，病毒感染激活而發生顯性感染［8］。而孕期和兒童HCMV感染較為嚴重，感染后幾乎能侵犯機體的所有器官，是引起出生缺陷和各種不可逆損傷的一個重要因素，是導致小兒先天畸形、智力低下、發育遲緩，造成多系統多臟器病變的重要病原［9］。由于小兒感染病毒后臨床表現多為非特異性，若不及時診斷和治療，會導致嚴重的后遺癥。因此建立早期、快速、靈敏、特異、可靠的檢測和診斷方法顯得格外重要。FQ－PCR技術是在常規PCR技術基礎上發展起來的，融匯了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量的優點，是目前準確和快速的微生物定量方法，能早期、靈敏檢測到HCMV－DNA，且可進行抗病毒治療效果監測［10］。本實驗采用FQ－PCR檢測技術將血液和尿沉淀HCMV－DNA結果的比較顯示，FQ－PCR檢測尿液的陽性率為57.55%，血液陽性率為44.34%，兩者比較（P＜0.05）差異有顯著性，可見尿標本FQPCR檢測HCMV的敏感性要高于血標本。是由于在急性感染期，腎臟的上皮細胞為病毒最易侵襲的場所，尤其是嬰幼兒的腎臟上皮細胞是較敏感的組織；血標本HCMV－DNA測定陽性，而尿標本HCMV－DNA測定陰性，則可能與HCMV尿液間歇性排毒有關［11］。當HCMV進入宿主以后，通過血液傳播到全身各器官，并從各感染部位排出病毒，如在尿液中檢測到高濃度的HCMV則提示患者體內HCMV處于活躍期并大量復制。尿液標本取材方便，無創，易為家長和小兒接受，所以采用FQ－PCR方法對小兒尿標本檢測能起到快速、簡潔、靈敏的作用，對提高HCMV感染的診斷率有實際的臨床意義。

有學者調查顯示，育齡婦女血清抗CMV－IgG陽性率為71.65%，提示我國育齡婦女大多數感染過HCMV［12］。大多數孕婦感染后處于潛伏性感染狀態，妊娠期由于體內激素變化引起病毒激活，而孕婦的血液、子宮頸分泌物是重要的傳染源，導致HCMV可能通過胎盤、產道引起母嬰傳播。作為產后感染HCMV的來源，母乳喂養一直未受到廣泛重視。本研究對通過母乳喂養的HCMV感染患兒或疑似感染患兒的母親乳汁進行檢測，顯示乳汁HCMV－DNA的陽性率達64.15%與國內文獻報道的結果相近［13］，其中，在患兒尿液 HCMV－DNA陽性且配對母乳陽性的占88.5%（54／61），尿液 HCMV－DNA陰性而配對母乳陽性的占31.1%（14／45）；在患兒血液HCMV－DNA陽性中，配對的母乳陽性占76.6%（36／47），患兒血液 HCMV－DNA 陰性中，配對的母乳陽性占54.2%（32／59），將其兩兩進行比較，具有顯著差異（P＜0.05），故推測 HCMV感染母乳可能是嬰兒感染HCMV的主要途徑之一。

綜上所述，母乳是嬰兒最理想的食物，其營養價值是其他配方乳品所無法替代的，因此如何快速檢測母乳是否感染HCMV，以及嬰幼兒的早期診斷有著十分重要的意義。FQ－PCR的推廣應用，對提高我國人口素質，實現優生優育有著深遠意義。

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