乳腺癌中CD44S和CD44V6基因蛋白表達的實驗研究

章 革，李 濤

（營口市婦產兒童醫院1.病理科；2.生殖科，遼寧 營口115000）

細胞粘附因子為一種細胞表面跨膜糖蛋白分子，分布于諸多細胞表面，包括淋巴細胞、單核細胞、RBC，成纖維細胞、上皮細胞、平滑肌細胞及腫瘤細胞等。CD44參與淋巴細胞的激活，以及細胞間透明質酸的特異性粘附，變異性CD44基因的多樣性表達與腫瘤的生長、轉移、復發等腫瘤生物學行為相關。我們應用免疫組化方法對乳腺癌中CD44S和CD44V6基因蛋白產物表達與組織學分型、脈管浸潤、淋巴轉移、預后、復發等相關性進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集本院2000年1月—2010年12月間，161例原發性乳腺癌根治術后的臨床病理及隨訪資料，最大年齡83歲，最小年齡29歲，中位56歲。病史9個月—6年，最長隨訪時間為7年。根據WHO（2003）乳腺癌分類及分級標準，進行組織學分類，其中乳頭狀癌38例占23.6%，浸潤性導管癌62例占38.5%，硬癌38例占23.6%，導管原位癌4例占2.48%，小葉原位癌8例占4.96%，其它11例占6.83%。在161例乳腺癌研究樣本中，有淋巴結轉移病例11例占6.8%。所有標本均由10%福爾馬林固定，石蠟包埋，選自最具組織學分型代表性、最大腫瘤表面積，常規4－5μm連續切片，分別作HE染色及CD44s、CD44V6、CD34免疫組化染色。

1.2.1 主要試劑 鼠抗人CD44S單克隆抗體（DF1485）、CD44V6單克隆抗體（2F10）、CD34單克隆抗體（OBEnd／10）、SP免疫組化試劑盒均購自福州邁新公司。

1.2.2 方法 所有標本均常規切片，采用兩步法免疫組化染色；石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液中120℃抗原修復，PBS代替一抗作為陰性對照。脈管浸潤實驗研究采用CD34單抗標記脈管內皮細胞，與H·E雙重染色鑒別血管、淋巴管。

1.3判斷標準CD44S200X全視野：（－）：陽性細胞數＜25%、（1＋）：陽性細胞數25%－50%、（2＋）：陽性細胞數50%－75%、（3＋）：陽性細胞數＞75%。CD44V6X200全視野：（－）：陽性細胞數＜25%、（1＋）：陽性細胞數25%－50%、（2＋）：陽性細胞數50%－75%、（3＋）：陽性細胞數＞75%。

脈管浸潤：以CD34陽性表達確認脈管內皮細胞，管腔內觀察到腫瘤細胞或瘤栓者為浸潤陽性。（管腔內觀察到RBC為血管，無RBC是淋巴管）。

1.4統計學分析采用SPSS11.5統計學軟件進行處理，各組間相關性檢測采用Spearman等級相關分析檢驗。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中，CD44S陽性表達為32.9%，CD44V6陽性表達為67.1%，CD44陽性表達，在各組織學類型之間無顯著性差異（表1）。

表1 CD44基因蛋白表達與組織學分型（%）

2.2 脈管浸潤病例，在各組織學分型中，依次為硬癌＞浸潤性導管癌＞乳頭狀腺癌（表2）。

表2 脈管浸潤與組織學分型

2.3 脈管浸潤與淋巴結轉移（P＜0.001）、遠隔轉移（P＜0.05）有顯著相關性（表3）。

表3 脈管浸潤與淋巴結轉移、遠隔轉移

2.4 腋窩淋巴結轉移灶與原發灶之間，CD44基因蛋白表達分別為：原發灶中，CD44S陽性表達73%，CD44V6陽性表達100%。腋窩淋巴結中，CD44S表達呈陰性，CD44V6陽性表達為64%（表4）。

2.5 應用CD34基因蛋白標記脈管內皮細胞，突出顯現脈管形態學特征并可直觀反映微血管生成狀態。

表4 腋窩淋巴結轉移灶與原發灶間CD44基因蛋白表達

3 討論

CD44是一種由單一基因編碼構成的一類具有高度特異性的多功能單鏈跨膜糖蛋白，其變構體CD44V6主要參與異質性黏附，即瘤細胞與宿主細胞及宿主基質的黏附，異質性黏附在癌細胞侵襲、轉移過程中起到促進作用［1］。另有觀點認為：CD44V6可能通過改變癌細胞的骨架結構和抗原位點的分布，獲得淋巴細胞樣免疫屏蔽，逃避機體免疫系統的識別，且更易于進入淋巴結形成轉移瘤［2］。本實驗研究檢測161例乳腺癌標本中，CD44S陽性表達 為 32.9%，CD44V6 陽性 表 達為 67.1%，CD44V6的陽性表達明顯高于CD44S。說明CD44S的表達是一個較為復雜的生物學過程，即在同一腫瘤組織中，表現出粘附因子基本型的缺失而變異體CD44V6呈高表達。由此可推論CD44V6的高表達與乳腺癌組織生長及臨床進展密切相關。同時，本實驗研究中還顯示，CD44基因蛋白表達與乳腺癌各組織學分型之間相關性不明顯。

而伴隨乳腺癌病程的進展，在腋窩淋巴結轉移灶中，CD44S表達缺失，CD44V6呈現高表達（64%），即原發灶中CD44S表達73%，CD44V6表達100%。提示已有轉移的病例中，原發灶和轉移灶中均能檢測出CD44V6的高表達；提示CD44V6陽性表達與乳腺癌進展、侵襲、轉移能力的增強有關［1，3］。

另外，在本研究中發現：CD44表達在腫瘤預后，復發統計中顯示：CD44V6的高性表達提示腫瘤預后不良，且證實與腫瘤的轉移潛能有相關性［4］。

血道和淋巴道轉移是乳腺癌最常見的轉移形式，腫瘤血管是其供應營養的物質的主要途徑，淋巴管是腫瘤細胞轉移的重要途徑［5］。本研究應用CD34標記脈管內皮細胞，突出顯現脈管形態學特征，同時配合HE復染，準確地觀察到了脈管內瘤細胞的浸潤及血管、淋巴管的鑒別。觀察結果顯示：CD34單克隆抗體 標記，內皮細胞著色清晰，脈管形態顯現明了。脈管內經Eosin復染可確切觀察RBC的有無，以此鑒別血管或淋巴管。應用該方法觀察發現：脈管浸潤與乳腺癌各組織學分型的生物學行為存在相關性，其發生率依次為硬癌＞浸潤性導管癌＞乳頭狀腺癌。脈管浸潤與淋巴結轉移（P＜0.001）遠隔轉移（P＜0.005）有顯著相關性，提示CD44基因蛋白產物的表達，與有脈管浸潤，淋巴結轉移、遠隔轉移及脈管浸潤與組織學分型及生物學行為中有直接或間接意義。

綜上所述，細胞黏附因子CD44S、CD44V6在乳腺癌轉移、復發等生物學過程中，發揮著生物介導、粘附作用。CD44S、CD44V6在癌組織中的強表達提示腫瘤復發、轉移、預后不良。腫瘤原發灶與轉移灶間CD44S表達缺失或減弱可能與CD44單抗的抑制、阻止及蛋白終產物生物學效應的改變相關。CD44的變異性表達可作為早期診斷瘤細胞浸潤轉移、預后的生物學指標。CD34基因蛋白標記脈管內皮細胞，突出顯現脈管形態學特征，可作為脈管內瘤細胞觀察及血管、淋巴管鑒別的客觀指標和方法。

［1］Yoshida R，Kimura N，Harada Y，et al.Th loss of E－cadlherinalpha－and bcta－catenin expression is associated with metastsis and poor prognosis in inyasive breast canccr［J］.Int J Oneol，2001，18（3）：513.

［2］Afify A，Purnll P，Nguyen L.Role of CD44sand CD44V6on human breast cancer cell adhesion migration and invasion［J］.Exp Mol pathol，2009，86（2）：95.

［3］張 真，張小濤，于 蘭，等.乳腺癌CD44V6和Survivin的表達與臨床預后的相關性研究［J］.中國腫瘤臨床，2011，38（14）：835.

［4］Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44：from adhesion molecules to signaling regulators［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（1）：33.

［5］甄樂平，葉長生，劉民風，等.D2－40和CD34在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其意義［J］.南方醫科大學學報，2010，30（7）：1548.