初步探討中國廣東人群的中性粒細胞CD177基因型和HNA-2a的表達①

徐秀章 夏文杰 葉 欣 丁浩強 陳揚凱 鄧 晶 邵 媛 王嘉勵

(廣州血液中心臨床輸血研究所，廣州 510095)

人類中性粒細胞除表達人類白細胞抗原、紅細胞ABH抗原等共有抗原外，還表達特有的糖蛋白，稱為中性粒細胞抗原(Human neutrophil antigen，HNA)。自1960年 Lalezari［1］發現首個人類中性粒細胞抗原以來，目前已檢出并命名了HNA1～5系統中的8個HNA抗原。研究證明［2］，中性粒細胞抗原在中性粒細胞的免疫激活和輸血相關性疾病方面起著重要作用，其抗體可導致多種臨床病癥，如同種免疫性中性粒細胞減少癥、自身免疫性中性粒細胞減少癥、藥物依賴性中性粒細胞減少癥、骨髓移植后移植物被排斥及輸血相關性急性肺損傷(TRALI)。在HNA系統中，人類中性粒細胞抗原－2a(HNA－2a)因其臨床重要性而受到廣泛關注。

HNA－2a之前被稱為 NB1，由 19號染色體19q13．3區域的 CD177基因編碼，分子量為56－64 kD。CD177基因的cDNA由1 311個堿基組成，編碼437個氨基酸，其中包括21個氨基酸的信號肽［3］。NB1糖蛋白屬于LY6基因家族，且與Ly－6基因家族的另一成員PRV－1具有高度的同源性，目前已被證實是一對等位基因［4］。PRV－1基因在真性紅細胞增多癥患者的中性粒細胞上大量表達，且與NB1基因之間存在4個堿基的區別，其中外顯子1第42位置上的堿基取代決定HNA－2a系統的抗原特異性，故多通過該位置對中性粒細胞的CD177進行基因分型。HNA－2a是一種高頻率抗原，其中在97%的高加索人、95%的非裔美國人及99．5%的日本中表達［4－7］。有3% ～5%的健康人表達非常低的HNA－2a，甚至有極少部分表達量＜5%，稱為 HNA－2－null型。目前認為 HNA－2－null型的產生與 mRNA合成過程中的剪切錯誤有關［2］。在HNA－2a表達陽性的個體中，并非所有的中性粒細胞都表達HNA－2a。在0%－100%范圍內的中性粒細胞有不同程度的 HNA－2a 表達(55% ±22%)［8］，且其表達量受多種因素的影響，研究發現 CD177基因的 SNPs與HNA－2a的表達水平相關。

本研究旨在通過PCR－SBT方法對中性粒細胞CD177(G42C)基因型進行檢測，獲得中國廣東人群的CD177的基因型;同時也采用流式細胞技術檢測該人群HNA－2a的表達，結合其基因型對可能影響HNA－2a表達的幾個因素(SNPs、年齡及性別)進行初步探討。

1 對象與方法

1．1 研究對象 隨機抽取83份體檢正常的無血緣關系的廣東籍無償獻血者，其中男53例，女30例，年齡介于20～54歲。每例標本抽取EDTA抗凝血10 ml。

1．2 主要儀器和材料 淋巴細胞分離液(密度ρ:1．077±0．002)購自上海華精生物高科技有限公司;DPBS購自廣州英韋創津生物科技有限公司;CD177－FITC(MEM－166)和鼠抗 IgG－FITC 抗體均購自美國BioLegend公司;EPICS－XL流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司;MJPTC－200PCR擴增儀;全血DNA提取試劑盒(購自德國QIAGEN公司);凝膠成像系統(美國UVP);3130測序儀(購自美國ABI公司)。

1．3 方法

1．3．1 中性粒細胞分離 將2 ml生理鹽水加入新鮮采集的全血中，混勻，再緩慢加入4 ml的淋巴細胞分離液中，2 000 r/min，離心20分鐘。棄上層血清及淋巴細胞，洗滌后加入1×氯化銨溶血素，冰上裂解5分鐘，1 500 r/min離心5分鐘，如紅細胞裂解不充分，可進一步裂解。用DPBS洗滌2次后，用1 ml的0．2%BSA/DPBS重懸，上機計數并將中性粒細胞的濃度調整為 3×106ml－1。

1．3．2 流式細胞儀檢測 分別取1．3．1中的粒細胞懸液100μl加入到兩支FACS管中，一管再加入2μl的MEM－166，另一管加入2μlm IgG(每個樣本均設有對照管)，4℃避光孵育20分鐘。之后加入2．5 ml的 0．2%BSA/DPBS，以 1 500 r/min 離心 5分鐘，棄上清。最后用300μl的0．2%BSA/DPBS重懸細胞，上機讀數。

1．3．3 基因組 DNA提取 EDTA抗凝靜脈血5 ml，按試劑盒提取DNA(詳細步驟見QIAGEN DNA提取試劑盒說明書)，－20℃保存。

1．3．4 PCR擴增及測序 合成PCR擴增引物:5HNA－2a:5'－GAGAGATTACCAGCCACAGACG－3';3HNA－2a:5'－GCACAGGGATCAAGGGAC－3'。 擴 增條件為94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，63℃退火30秒和72℃延伸30秒，共30循環，72℃最后延伸5分鐘后冷卻至4℃。對擴增的PCR產物進行酶切純化后，將擴增引物作為測序引物進行測序PCR，反應條件如下:96℃預變性2分鐘，96℃變性10秒，50℃退火5秒和60℃延伸4分鐘，共25循環。純化變性后上機測序。

1．4 統計學分析 用SPSS13．0軟件進行統計學分析。對83例CD177基因型測序結果和HNA－2a表達量的流式檢測結果進行T－檢驗和單因素方差分析，若P＜0．05，認為有統計學意義。

2 結果

2．1 廣東人群中中性粒細胞HNA－2a的表達與年齡及性別的關系 通過流式細胞術對83名廣東籍無償獻血者HNA－2a的表達進行檢測，其表達量均超過5%(HNA－2a表達量低于5%，認為HNA－2a表達陰性)。HNA－2a在83例獻血者的中性粒細胞表達的百分比為61．37%±17．87%，MFI為4．87±1．41(見表 1、圖 1)。對不同性別及女性不同年齡段(≥40歲者與＜40歲者)HNA－2a的表達量進行T－檢驗，P＞0．05，統計結果表明，男性與女性對HNA－2a的表達無明顯差異，且女性隨著年齡的增加對HNA－2a的表達量亦無明顯影響。

表1 不同性別及年齡對HNA-2a表達的影響Tab．1 The effects of gender and age on HNA-2a expression in Guangdong population

表2 CD177的基因型及HNA-2a流式表達結果Tab．2 CD177 genotype and the results of HNA-2a exp ression by flow cytometry

2．2 中國廣東人群 CD177的基因型及 SNPs對HNA－2a表達的影響 根據CD177基因在1號外顯子42位的單核苷酸多態性(SNPs)，采用PCR－SBT法對83份標本的 CD177進行基因分型，表現為42C/C、42C/G和42G/G三種基因型，其中42C/C與42C/G為中國廣東人群中常見的CD177基因型，分別占48．19%與44．58%;而42G/G較少見，僅占7．23%(見表2、圖2)。

此外，對不同基因型的無償獻血者 HNA－2a的表達量進行單因素方差分析(見表2)，統計顯示，42C/C與42G/G基因型之間，其 HNA－2a表達的MFI存在顯著影響(P=0．047＜0．05)，表明 G42C 基因多態性可影響HNA－2a的表達。

3 討論

圖1 HNA-2a表達的流式細胞分析結果Fig．1 Flow cytometry of HNA-2a expression

圖2 HNA-2a基因分型測序結果Fig．2 The genotype of HNA-2a analyzed by nucleotide sequencing

HNA－2a作為GPⅠ連接膜糖蛋白僅表達于中性粒細胞亞群［9，10］，且表達存在明顯的個體差異。研究認為可能與以下兩個機制有關［4，11－15］:一，機體狀態的影響，激素、炎癥、感染、接受G－CSF治療及骨髓增生性疾病等因素可影響CD177的基因調控和蛋白加工，從而導致HNA－2a表達增加。據文獻報道HNA－2a在中性粒細胞的表達，女性高于男性，特別是妊娠期婦女HNA－2a中性粒細胞數明顯增加［12］。二，基因水平的影響，CD177是一個多態性基因，一些高頻的SNPs可能會影響到中性粒細胞表面的蛋白表達，例如 G42C。A793C及 G1084A等，其中最常見的SNPs為G42C，單核苷酸其多態性使得參與細胞從內質網到質膜和次級顆粒進行蛋白搬運的前導序列的氨基酸發生改變，從而影響到細胞表面蛋白質的表達量［16］。

本研究首先采用流式細胞術檢測中國廣東人群HNA－2a的表達，發現 83例無償獻血者均表達HNA－2a 抗原，其表達量為61．37% ±17．87%。本實驗也對HNA－2a在不同性別及女性的不同年齡段的表達量進行相關性分析，統計結果顯示女性與男性之間HNA－2a的表達量無差異，且 HNA－2a在≥40歲與＜40歲女性中性粒細胞之間的表達無明顯區別，此與之前文獻報道的不一致［12］。分析原因可能與本實驗樣本量少有關;亦或者雌激素并不影響HNA－2a的表達。其次，通過對83名健康無償獻血者CD177基因(G42C)進行測序分析，獲得中國廣東人群基因型結果是42C/C和42C/G多見，而42G/G 少見，分別占 48．19%、44．58%和 7．23%。而Caruccio等［4］得到的實驗結果是42G/G與42C/C 多見，42C/G 較少見，分別占50．00%、43．75%及6．25%，兩者結果存在很大差異，分析原因可能與人種不同有關。因為本研究著眼于位于中國南方地區的廣東人群，而Caruccio等研究人群則由11名非裔美國人和12名高加索人組成，兩者在人種遺傳和地域等方面存在很大差距，故初步推測中國廣東人群CD177基因的G42C存在其獨特性。本研究亦分析CD177基因的G42C多態性對HNA－2a表達量的影響，統計數據顯示，42C/C基因型獻血員其HNA－2a表達的MFI明顯高于42G/G基因型者(P＜0．05)，表明SNPs(G42C)會影響HNA－2a的表達量。

總之，NB1作為最重要的中性粒細胞抗原之一是目前輸血免疫領域研究的熱點，其臨床重要性在國外得到廣泛地關注，但國內對HNA－2a的研究甚少。本研究通過PCR－SBT方法和流式細胞術，獲得了中國廣東人群CD177的基因型及HNA－2a的表達情況，并對影響HNA－2a表達的幾個因素進行了初步探討，這對今后對NB1功能研究及由NB1引起的臨床輸血相關性疾病的研究提供了理論基礎。

1 Lalezari P，Nussbaum M，Gelman S et al．Neonatal neutropenia due tomaternal isoimmunization［J］．Blood，1960;15(2):236－243．

2 Bux J．Human neutrophil alloantigens［J］．Vox Sang，2008;94(4):277－285．

3 Kissel K，Scheffler S，Kerowgan M et al．Molecular basis of NB1(HNA－2a， CD177)deficiency［J］． Blood，2002;99(11):4231－4233．

4 Caruccio L，Walkovich K，BettinottiM etal．CD177 polymorphisms:correlation between high－frequency single nucleotide polymorphisms and neutrophil surface protein expression［J］．Transfusion，2004;44(1):77－82．

5 Bux J．Molecular genetics of granulocyte polymorphisms［J］．Vox Sang，2000;78(Suppl 2):125－130．

6 Taniguchi K，KobayashiM，Harada H et al．Human neutrophil antigen－2a expression on neutrophils from healthy adults in western Japan［J］．Transfusion，2002;42(5):651－657．

7 Moritz E，Chiba A K，Yamamoto M etal．Human neutrophil antigen－2a expression in the Brazilian population［J］．Transfusion，2008;48(Suppl2):179A．

8 Matsuo K，Lin A，Procter J L et al．Variations in the expression of granulocyte antigen NB1［J］．Transfusion，2000;40(6):654－662．

9 Goldschmeding R，van Dalen CM，Faber N etal．Further characterization of the NB1 antigen as a variably expressed 56－62 kD GPI－linked glycoprotein of plasmamembranes and specific granules ofneutrophils［J］．Br JHaematol，1992;81(3):336－345．

10 Clement L T，Lehmeyer JE，Gartland G L．Identification of neutrophil subpopulations with monoclonal antibodies［J］．Blood，1983;61(2):326－332．

11 Wolff J，Brendel C，Fink L et al．Lack of NB1 GP(CD177/HNA－2a)gene transcription in NB1 GP－ neutrophils from NB1 GP－expressing individuals and association of low expression with NB1 gene polymorphisms［J］．Blood，2003;102(2):731－733．

12 Caruccio L，BettinottiM，Matsuo K etal．Expression of human neutrophil antigen－2a (NB1)is increased in pregnancy ［J］．Transfusion，2003;43(3):357－363．

13 Taniguchi K，Nagata H，Katsuki T et al．Significance of human neutrophil antigen－2a(NB1)expression and neutrophil number in pregnancy［J］．Transfusion，2004;44(4):581－585．

14 G?hring K，Wolff J，Doppl W et al．Neutrophil CD177(NB1 gp，HNA－2a)expression is increased in severe bacterial infections and polycythaemia vera［J］．Br JHaematol，2004;126(2):252－254．

15 Passamonti F，Pietra D，Malabarba L et al．Clinical significance of neutrophil CD177 mRNA expression in Ph－negative chronic myeloproliferative disorders［J］．Br JHaematol，2004;126(5):650－656．

16 Anjos S，Nguyen A，Ounissi－Benkalha H et al．A common autoimmunity predisposing signal peptide variantof the cytotoxic T－lymphocyte antigen 4 results in inefficient glycosylation of the susceptibility allele［J］．JBiol Chem，2002;277(48):46478－46486．